激光后上皮下雾状混淆的研究进展

激光后上皮下雾状混淆的研究进展

准分子激光研磨矫正手术包括准分子激光屈光度膜成像（rc）、准分子激光原膜磨成术（lasik）、准分子激光自适应面磨成术（lasek）和准分子激光自适应面磨成术（epi-lasik）。由于lasik有自己无法克服的膜瓣并发症，近年来，平面面漆技术（prk、lasek、epi-lasek）再次受到关注，安全操作简单的优点，而平面膜切开术（prk）、散列面漆、术后疼痛和视力恢复缓慢。其中，散列是影响其广泛发展的主要因素。本文就近年来haze的研究进展作一简要综述。一、lasik的术后表现及术后疗效不同手术方式haze的发生率有所不同。PRK术后常有明显的haze发生,且切削越深术后haze越明显。LASEK手术虽然haze发生率较PRK少,但在高度近视眼中仍不能完全避免。2003年开展的Epi-LASIK手术初期临床报道显示haze的发生较LASEK更少。LASIK手术保留了完整的上皮组织和前弹力层,其术后基本无haze发生。正常的角膜上皮厚约50μm,基底膜150nm,前弹力层厚约8～14μm,基质层厚约500μm。这些结构中,人们开始关注最薄的基底膜。正常情况下,角膜基底膜能够结合细胞因子,被破坏时可能会影响到对一些信号分子的屏障作用,而这些信号分子通常带有对角膜细胞和炎症细胞有趋化和促有丝分裂作用的信息,从而促进创伤的愈合反应。在PRK手术中角膜上皮、基底膜和前弹力层均被破坏,从而使基质浅层的细胞直接暴露于受损上皮和泪液的各种细胞因子中,启动创伤修复过程。LASEK手术保留有角膜上皮,乙醇浸泡制瓣的平面位于基底膜的透明板和致密板之间,故术后也会启动角膜创伤的修复反应,导致haze的形成。另一方面,由于保留了上皮瓣,一定程度上保护了基质免受泪液中各种因子的影响,其haze发生率低于PRK。Ivarsen等发现在LASIK术后第一天,切缘的缺损上皮已经愈合,而该处的基底膜仍然中断,这种明显的中断限定了其下方基质创伤修复的范围,术后第6个月,可看到瓣缘的基质有纤维化,这种现象与基底膜的屏障作用受损有关。Pallikaris等发现Epi-LASIK的上皮瓣包含有较完整的基底膜组织,其制瓣平面位于基底膜下方,术后患者无明显haze形成。初步研究显示Epi-LASIK较LASEK效果更佳,基底膜完整可能是其术后haze不明显、临床效果更佳的重要原因。不同手术方式对haze形成有不同影响,深层次的原因需从分子病理生理学的角度进行探索。二、伤口的恢复过程与赫兹的关系准分子激光手术对于角膜组织首先是一创伤刺激,故haze的发生与角膜组织的创伤愈合反应有直接关系。(一)肿瘤相关因子检测Wilson等提出角膜创伤修复反应的始动因素是角膜细胞的凋亡。而凋亡过程又受到多种因素影响:1.细胞因子:Wilson等发现受损的角膜上皮组织有促进角膜细胞凋亡的作用,尤其是角膜周边的上皮组织,这种作用更明显。这与上皮组织分泌的许多细胞因子有关,而且不同部位的角膜上皮分泌细胞因子的能力也不同。很多研究表明,创伤后角膜上皮细胞分泌的白细胞介素-1(IL-1)与角膜细胞的凋亡有关。当IL-1与基质浅层角膜细胞表达的IL-1受体结合后,可诱导具有Fas受体的角膜细胞表达FasL,继而执行自分泌性死亡。在合适的环境下,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)也能促进角膜细胞凋亡。Mohan等发现角膜组织中有TNF-α及其受体的表达,TNF-α在诱导角膜细胞凋亡的同时还会激活转录因子NF-κB,而后者通过刺激TNFR相关因子(TRAF-I、TRAF-2)以及凋亡蛋白抑制物(IAP1、IAP2)的转录来抑制TNF-α凋亡信号的转导,对TNF-α介导的凋亡起负调节作用。此外,人们在角膜细胞中同时检测到骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-4)及其受体的表达,而BMP-2和BMP-4可诱导神经嵴起源的细胞(角膜细胞和内皮细胞)凋亡及分化。由此可见,创伤后角膜细胞的凋亡是一个多种细胞因子参与的过程。2.基因调控:角膜细胞凋亡也是多基因调控的过程。目前关注较多的是fas基因,它可使细胞表达fas受体,当fasL与其结合后可以促进该细胞凋亡。当角膜上皮受损时,该区域基质浅层的角膜细胞也会表达fas,除了前述IL-1介导的自分泌性死亡外,受损的上皮细胞也可直接释放fasL,使这些角膜细胞发生旁分泌性死亡。除fas基因外,bax基因也有促进凋亡的作用,而bcl-2、bcl-xl等基因的产物则可抑制凋亡。Wilson在原代培养的3种角膜细胞中检测到了bcl-2、bcl-xl和bax基因的mRNA,提示这些基因均参与了角膜细胞凋亡的调控。3.其他:不同的角膜损伤方式及角膜上皮在光损伤后释放的一些活性氧簇(ROS)等,也可能与角膜细胞的凋亡有关。角膜细胞凋亡作为创伤修复的起始阶段机制非常复杂;而凋亡后局部会产生一个相对的无细胞区,促使附近的角膜细胞活化、增生,并在向该区域迁移的过程中向肌成纤维细胞分化、合成新的胶原和基质重构,最终导致haze发生。因此可以认为,凋亡也是haze的始发因素。(二)免疫组织相关因子角膜细胞凋亡后,将发生一系列的创伤修复级联反应,包括角膜细胞的增生、迁移和分化。Zieske等用Ki67(一种细胞周期相关蛋白)来标记角膜细胞后发现,在刮除角膜上皮28小时后,无细胞区的周围和深面开始有Ki67表达,44小时到达高峰,以后逐渐下降,这提示大部分的角膜细胞只进行了一次增生,第二次增生发生在这些细胞迁移进入无细胞区后。至于是什么因素促使角膜细胞开始进行分裂,机制尚不甚明了,可能与上皮释放或泪液中含有的一些细胞因子有关;也可能与基底膜破坏后释放的血小板源性生长因子(PDGF)有关,Kim等发现PDGF在正常角膜基底膜中大量存在,释放后与角膜细胞上的PDGF受体结合促进其活化、增生、迁移。在创伤后的3周内,活化的角膜细胞通过增生、迁移,逐渐充填无细胞区,同时合成新的基质,这种基质较原先有所改变。这种改变又可反过来影响活化的角膜细胞迁移。在创伤后的12～24小时内,创伤边缘出现纤维连接蛋白的沉积,同时,活化的角膜细胞表达整合素α5β1,接下来的24～48小时开始出现细胞黏合素。Andresen等认为纤维连接蛋白和整合素α5β1的表达增加可能是促进活化的角膜细胞向无细胞区迁移的主要因素;细胞黏合素是一种抗细胞黏附的基质蛋白,它能使细胞和纤维连接蛋白间的接触变得不稳定,从而促进角膜细胞的迁移;此外,早期仅有硫酸软骨素在伤口处沉积,它可以增加胶原间的空隙,促进角膜细胞迁移并充填无细胞区,使该处变混浊。直到硫酸角质素的合成恢复正常后,角膜才重新恢复透明。角膜细胞在增生、迁移的过程中还可能发生分化,向肌成纤维细胞转变。而这种含有独特表型α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的细胞与角膜的纤维修复及haze的形成密切相关。Wilson等在三组兔角膜上制作了相同的基质瓣,并在其中两组瓣下分别置入角膜的边缘上皮组织和中央上皮组织,第三组作为空白对照,术后观察到实验组切面前后缘的角膜细胞均表达了α-SMA,这提示上皮组织可促使角膜细胞向肌成纤维细胞转化,这与其释放TGF-β有关。此外,研究发现类似角膜板层切除这样的创伤会诱导很多肌成纤维细胞产生,但Zieske等在角膜上皮刮除实验中却发现角膜细胞虽然活化却未转变为肌成纤维细胞,Stramer等发现在刮除上皮而基底膜完整的模型中,TGF-β仍然限于上皮细胞内,同时无纤维修复的发生,这些均提示完整的角膜基底膜可保护下方的基质免受TGF-β影响,减少角膜细胞向肌成纤维细胞分化,抑制纤维修复,从而减少haze的发生。(三)免疫因子及免疫创伤修复过程离不开诸多细胞因子的参与。它们可分四类:①由上皮细胞产生作用于角膜细胞,包括TGF-α、IL-1;②由上皮和角膜细胞产生,通过自分泌和旁分泌机制作用于它们自己,包括IGF-1、TGF-β1、TGF-β2、PDGF、bFGF;③由角膜细胞产生作用于上皮细胞,包括KGF、HGF;④由上皮或角膜细胞产生,作用于炎症或免疫细胞,包括IL-8和巨噬细胞集落刺激因子。此外,泪腺也分泌一些细胞因子,包括TGF-α、HGF、EGF和bFGF等,也有重要的调节作用。与角膜细胞增生、迁移、分化关系较密切的因子主要有:①TGF-β被认为是准分子激光手术后诱导角膜基质纤维化的关键因子,它可诱导角膜细胞表达α-SMA,用抗体阻断TGF-β,可显著减少肌成纤维细胞的出现,从而减少PRK术后haze的发生。Kaji等对兔施行PRK术,术前仅在上皮和内皮细胞中检测到TGF-β1的表达,刮除上皮对之无影响,术后4周时在激光切削区的基质浅层内增生的角膜细胞中检测到TGF-β1的表达,而其他部位的TGF-β1表达无变化,这种变化提示了TGF-β1在创伤修复中的作用。而Stramer等研究发现,TGF-β2是上皮细胞产生的生长因子,当基底膜受损时会被释放入基质,促进角膜细胞向肌成纤维细胞分化,导致纤维化的发生。②人的角膜上皮细胞、内皮细胞和角膜细胞均可合成PDGF及其受体,表明它可以通过自分泌和旁分泌作用于角膜细胞。PDGF有三种异构体,PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB。Imanishi等研究表明,一定浓度的PDGF-BB可促进活化的角膜细胞迁移,而PDGF-AA则无此作用。此外,它还可以协同TGF-β诱导角膜细胞的增生和分化。③在一些体外实验中发现IGF-1、TGF-α、EGF也可促进角膜细胞的迁移,促进创伤修复。综上可见,细胞因子在角膜创伤的修复过程中起着复杂而又重要的调节作用,它与haze的发生密切相关。(四)haze发生的原因Haze的形成与角膜透明性下降有关。角膜的透明需要角膜细胞和细胞外基质对光线均保持良好的通透性。正常的角膜细胞胞浆内含有很多晶体蛋白,它是一种水溶性的球蛋白,参与透明角膜的发育,能帮助可见光通过,它的浓度一定程度上决定了角膜细胞的屈光指数和对光线的散射能力。正常情况下,角膜基质层胶原纤维粗细均匀,排列成规则的网栅状,而整个角膜处于水分平衡状态,故每条胶原纤维向旁边的散射光线均会被相邻纤维的散射光线所抵消;同时胶原的直径(约30nm)和胶原间的距离(约60nm)与可见光波长(400～700nm)相比显得很小,对光线的阻隔也少,这均有助于细胞外基质的透明。而创伤后新合成的基质中取而代之的是许多肥大的肌成纤维细胞和粗大而排列紊乱的胶原纤维。在肌成纤维细胞中,晶体蛋白明显减少,故其对光线的通透性下降,这种细胞在基质浅层的大量堆积导致了光线散射的增加,这是haze发生的原因之一。而粗大的胶原和不规则的胶原间距离也改变了原先与可见光波长之间的关系,M《ller-Pedersen认为当胶原的直径或间距大于最短可见光波长的一半(约200nm)时,对光线的散射性将大大增加,从而影响角膜的透光性,导致haze的发生。创伤修复的最终结果往往是大量肌成纤维细胞在受损基质处聚集,合成新的胶原蛋白和细胞外基质,然后其内的平滑肌样结构收缩,通过“鞋带样”收紧的机制使基质重新排列,如果这一过程过度就会发生角膜透明性下降,导致haze发生。此外,正常角膜的基质中含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型胶原蛋白,以Ⅰ型为主,Ⅵ型胶原蛋白在保持角膜基质的有序板层结构方面起重要作用,而创伤后新合成的胶原以Ⅲ型胶原蛋白为主。许多实验表明,新合成的胶原蛋白在1～3个月时达到高峰,6～12个月时减少至消失,其动态变化曲线与haze分级变化曲线相似,提示新的胶原纤维合成与haze的发生有关,可能的原因为新合成的胶原纤维是以瘢痕的主要成分——Ⅲ型胶原蛋白为主,结构粗大,排列紊乱,其直径及相互间隔不规则,影响了对光线的通透性。总之,角膜创伤的愈合过程与haze的形成关系密切,然而此过程中很多机制并未被完全阐明。三、其他与屋顶有关的因素(一)不同种人所通过激光手术的刺激效果haze的发生与患者年龄、术前眼压、欲矫正的屈光度、伤口愈合的个体差异等有关;此外,已知深色人种比浅色人种更易在皮肤组织受损后形成瘢痕,故不同人种角膜组织对激光手术的刺激反应也可能不同。Tabbara等对PRK术后的150例266眼回顾性研究发现,棕色眼的沙特阿拉伯人角膜haze发生率较蓝色眼的白色人种明显高。(二)prk的时机选择紫外线辐射也可能与PRK术后的ha