2023动物钩端螺旋体病诊断技术

动物钩端螺旋体病诊断技术IIII引 言（Leptospira300151515（PCR），PCR1:400ELISAELISA本标准的制定参考了世界动物卫生组织(OIE)中《陆生动物诊断试验与疫苗手册2021》给出的部分章节，并结合我国相关技术研究新成果制定，在技术上与国际先进技术保持一致。PAGEPAGE10动物钩端螺旋体病诊断技术范围本标准规定了钩端螺旋体病病原检测和抗体检测的操作方法。本标准适用于疑似家畜及犬猫钩端螺旋体病的诊断。GB19489GB/T14926.42实验动物细菌学检测标本采集本文件没有需要界定的术语和定义。缩略语下列缩略语适用于本年文件PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）MAT：显微凝集试验（MicroscopicAgglutinationTest）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）PBS：磷酸盐缓冲溶液（PhosphateBufferedSalineBffer）①体温升高。②消化道症状：呕吐、腹泻和便血。⑤结膜炎。⑥血红蛋白尿。⑦牛、羊等反刍动物以及猪还会出现流产、死胎、产弱仔和不孕症。①组织器官黄染。动物出现5.1典型临床症状2条以上或5.2典型病理变化1条以上，可判为疑似钩端螺旋体病。器材（1.5、2、10。（2.5、5、10、20。试剂EMJH培养基，配方见附录B的B.1样品处理的生物安全措施按照GB19489进行。（）（12-5（超过1）-20PCR0.4-1%100–200μg/mL5-EMJH滴于5261003（PCR）检测器材PCR（）（5μL、10、100、200、1000）（200、1.5mL）试剂DNA灭菌水50TAEBB.2）DNAMaker（）:100bp至2000bp。）（DNA。:56601。:SPFDNA1ng/μL。引物A5GAGCAG35AGCTCG’B5CGGCAG35AGCTAGG’C5GGCGTG35AGTCCCCG’引物用无RNase水稀释至10μM备用。

468bp468b468A（60660（560（560566566566（56656613B（66055655566C（66025604566体系将去子、性照样本板特性物操作明入下25μL反应体中：预混酶 12.5μL三对下引物 各1μL（共6模板 3μL（大于3.95×10-5ng/μL）去离水 3.5μL预变性94℃，2min，变性94℃，30s，退火60℃，30s，延伸72℃，30s（变性到延伸扩增35个循环），最后延伸72℃，5min。1%B的B.37μLDNAMarkerV25–30电泳结束后，取出凝胶板放置于凝胶成像仪上观察，阴性对照没有扩增条带，阳性对照在468bp处有扩增条带。468bp468bp468bpPCR3PCR1PCR2PCR33阴性。（MAT）器材采血管96孔板水浴锅（50μL）（1.5mL）试剂PBSB的B.4）SPF兔血清）SPF）GB/T14926.42EMJH±1下培养4-8钩体5630min用PBS（pH7.4）1:259650μLPBS+50μL50μL+50μL50μL+50μL1:5050μL+50μL待3-5。2h。50%50μLPBS+50μL50μL阴性血清+50μL3100μL血清（1:25），50μLPBS350μL50μL50μL+50μLMAT结果判定如下：①++++：暗视野下几乎全部钩体呈蜘蛛状凝集或者折光率高的团块，仅有少量游离的钩体存在。②+++：75%的钩体被凝集，大部分呈现块儿状或者蜘蛛状，视野下仍有25%游离的钩体。③++：50%50%④ 75%⑤—：全部菌体正常，没有凝集的团块，钩体数量和对照的相同。阴性血清无凝集，阳性血清出现凝集达“++”或者以上，试验成立。待测血清的凝集效价在1：50达到“++”或者以上，判读为阳性。MAT1伴有典型临床症状的动物，其血清样本在恢复期（无典型临床症状）和急性期（有典型临床症状）的抗体滴度相差4倍，可判定为钩端螺旋体病。2无典型临床症状，但其血清抗体滴度达到或超过1:400的情况下，可判定为钩端螺旋体病。诊断①符合5.3的疑似钩端螺旋体病判定；②除肾脏以外的内脏器官样本，以及体液样本病原检测为阳性；③肾脏或尿液病原检测为阳性；④血清MAT检测抗体滴度超过1:400或恢复期和急性期抗体滴度相差4倍；若不符合①②④；但符合③，则诊断为钩端螺旋体携带者，非钩端螺旋体病。。附录A（资料性附录）钩端螺旋体病的鉴别诊断（M附录B（资料性附录）试剂配方EMJH培养基配制方法：基础培养基（50×1L）：Na2HPO4 50gKH2PO4 15gNaCI 50g10%油 50mL25%NH4Cl 50mL蒸馏水 900可换成哈纯水）10%NaOH（）调节PH7.40.22μm4补充培养基（BSA100g(可以先用500mL蒸馏水/哇哈哈纯净水溶解)氯化硫胺素（0.5%）10mLCaCl2-2H2O(1%)10mLMgCl2-6H2O(1%)10mLZnSO4-7H2O(0.4%)10mLMnSO4-4H2O(0.3%)1mLFeSO4-7H2O(0.5%)100mLTween80溶液（10%）125mL蒸馏水（可换成哇哈哈纯净水）734mL（定容1L）合成最终培养基(1L):基础培养基880mL补充培养基100mL兔血清10mL5-氟尿嘧啶10mL50×配制方法：242g18.6g去离水 800mL冰乙酸 57.1mLNaOH调pH至8.3后，去离子水定容至1L。1%琼脂糖凝胶板的制备：称取1g琼脂糖，加入100mL1×TAE缓冲液中。加热融化后加3μL核酸染料，预混后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚度5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔）