受激发射损耗(STED)荧光显微镜

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something荧光物质有机荧光物质是一类具有特殊光学性能的化合物,它们能吸收特定频率的光,并发射出低频率(较长波长)的荧光来释放所吸收的能量。某些有机化合物在紫外和短波长的可见光的激发(这种用来激发的光叫激发光)下能发出荧光,产生可见光谱中鲜艳的颜色,这类物质称为日光型荧光染、颜料。

荧光物质分子一般都含有发射荧光的基团(称为荧光团)以及能使吸收波长改变并伴随荧光增强的助色团

受激发射损耗的基本原理如果你有一根粗笔，怎么能够用它画细线？买块橡皮。先画个粗的，再擦去两边的多余部分.STED用的就是这个原理。使用一种合适的激光,仅激发一个点的荧光基团使其发光,然后再用一个面包圈样的光源抑制那个点周围的荧光强度,这样就只有一个点发光并被观察了.

受激发射损耗的基本原理激发光可以使基态荧光粒子从基态跃迁到激发态,随后用损耗光(损耗光就是用来损耗荧光的光)照射样品,引起荧光物质的受激辐射,消耗了可以发射荧光的能级(荧光态)上的粒子数。受激辐射的作用是迫使粒子在它们被激发之后立刻回到基态,使焦斑上那些受到损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力,而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内,于是获得了一个小于衍射极限的发光点.激发光将基态粒子激发到激发态后,向下跃迁的几率K=σ×I.其中σ是分子的吸收截面,I是损耗光的光强.损耗光的光强越大,损耗的荧光分子越多通过损耗后,外围的荧光被强烈地损耗而留下中心的荧光,但是边缘仍会有残留荧光,可以通过改变入射光波的波前分布来模糊边缘的荧光.荧光的产生是自发辐射,处于激发态被损耗光照射后是受激辐射,受激辐射发出的光子与吸收的光子相同,选择合适的波长的损耗光就可以使激发态的染料发出特定波长的光(激光的原理).损耗光的波长要选在荧光发射谱的红边,以避免重激发,激发光与损耗光的时间差要选的合适,既保证有荧光产生,又能保证一定的损耗几率.STED荧光显微镜示意图环形的损耗光是利用一个位相片进行光位相调制，最终在焦点处形成环形光分布。按顺序先给激发脉冲(2ps左右)，等荧光物质跃迁上去了,马上给一个受激辐射波长的脉冲（250ps左右），用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射，探测过来的自发辐射信号,移动样本就可以三维成像.起初的主要用于突破STEM显微镜主要用于突破横向衍射极限,横向分辨率可达70nm,而轴向分辨率还较低,因为有限的孔径角导致轴向分辨率降低.近来将和4pi显微术互补性地结合,在技术上扩大了有效孔径角.目前已经获得了100nm的轴向分辨率.荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质：

某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线—荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光(EXCITATION)：

能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)488nm520nm异硫氰酸荧光素(FITC)发射光(EMISSION):

发射光谱；发射波峰(最大发射波长)荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI,Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):

组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。漂白(BLEACH)：

荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失—漂白。二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。

带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490

长、短通滤色镜组合（LP+KP）：LP450+KP490

双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光488nm520nmFITC450nm490nm荧光显微镜的不足:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度不够。6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠7.只能在二维环境下观察。8.样品不能太厚。9.荧光的串绕无法回避。10.放大倍率小。2.基本组成一、基本组成（一）激光器:多线氩离子(458nm,488nm,514nm)、氦氖绿(543nm)、氦氖红(633nm)（二）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器)（三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。（四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。3.共聚焦原理利用照明针孔和探测针孔实现点照明和探测，并且被探测点位于焦平面。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点。共聚焦原理共聚焦原理1.点照明（为作图方便已将光线发散角放大）共聚焦原理假设是场照明（非共聚焦），会导致：一.发生衍射，使像模糊；

二.散射光干扰（即除了成像点外，其余点处有散射光进入探测针孔）；

而点照明则不会有这些问题。共聚焦原理消除衍射影响消除背景杂光共聚焦原理2.焦平面点成像共聚焦原理焦平面上的像是最清晰的，从上面的图可以看出，非焦平面点所成的像的光像被探测针孔挡住，不会进入光探头，所以焦平面点成像使像更清晰。共聚焦原理所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像质量。4.X—Y轴扫描奥林巴斯Fluo