颌骨成釉细胞瘤中凋亡相关蛋白表达的研究

颌骨成釉细胞瘤中凋亡相关蛋白表达的研究

成耀细胞瘤是最常见的下颌牙齿肿瘤。虽然属于良性肿瘤，但其生长具有局部入侵性，术后复发率较高。其组织学表现多样,以滤泡型和丛状型最为常见,肿瘤细胞发生广泛的鳞状化生或颗粒变性还可分别构成棘皮瘤型和颗粒细胞型两种变异型,其它较少见的组织学类型还包括基底细胞型、促结缔组织增生型、角化成釉细胞瘤等。目前认为这些组织学分型与肿瘤临床行为之间并无明确的相关关系,并主张将成釉细胞瘤简明地分为经典骨内型(实性型或多囊型)、单囊型和周边型等三种临床病理亚型。但是由于影响肿瘤预后的因素很多,且成釉细胞瘤的发生、发展和细胞分化机制仍不清楚,成釉细胞瘤的组织学表现与其生物学行为的关系仍需要深入研究。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的死亡,在多细胞的生物体中,细胞死亡是与细胞增殖和细胞分化同样重要的生命过程,在肿瘤组织中也不例外。大量研究表明,肿瘤在其发生发展过程中可表现多种细胞凋亡相关基因的改变,其在肿瘤组织中的作用机制可能直接影响肿瘤的进展和预后。近年来,已有学者开始关注颌骨牙源性病损中的细胞凋亡现象及凋亡相关基因的表达,但国内目前这方面的报道还较少见。本研究旨在观察经典骨内型成釉细胞瘤中几种凋亡相关蛋白的表达以及细胞凋亡的分布,探讨其与成釉细胞瘤中常见的细胞分化和变异之间的相关关系。细胞凋亡检测选取北京大学口腔医院2000～2003年收治的成釉细胞瘤39例,均为经典骨内型病例。记录其主要临床资料并复习HE切片,按WHO分类分为滤泡型及丛状型,并观察其细胞分化及变异情况。免疫组化染色(SP法):所用第一抗体分别为兔抗人Fas(1:400,SantaCruz公司)、兔抗人FasL(1:100,SantaCruz公司)、兔抗人caspase-3(1:200武汉博士德生物工程公司)、鼠抗人bcl-2(北京中山生物技术公司,采用pH6.0枸橼酸缓冲液中微波加热修复抗原10分钟)、鼠抗人Ki67(北京中山生物技术公司,采用微波加热10分钟、胰酶消化5分钟修复抗原)。DAB显色,苏木素复染。以TBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。光镜下观察记录阳性率及阳性染色在不同分化或变异程度的肿瘤细胞(包括肿瘤上皮岛中心星网状细胞、外周基底细胞、鳞状化生细胞及颗粒变性细胞)中的分布及阳性强度[强阳性(+)、弱阳性(±)和阴性(-)]。TUNEL法标记凋亡细胞:选取9例滤泡型、2例丛状型成釉细胞瘤,检测凋亡细胞的分布。细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物工程公司,dUTP以地高辛标记,SABC法放大信号,DAB显色,苏木素复染。光镜下观察,染色质浓缩的细胞核呈棕色的细胞为阳性。统计分析:使用SAS统计分析软件包8.01,采用χ2检验分别分析成釉细胞瘤两种主要组织学类型间各抗原表达阳性率的差别及肿瘤的不同细胞成份间各抗原表达阳性强度的差别,采用Spearman非参数相关分析检验各抗原表达阳性率之间的相关关系。免疫组织中fas、caspase-3和bcl-2表达的表达39例成釉细胞瘤中男16例,女23例,年龄11～73岁,平均36岁。发生于上颌者6例,下颌33例,病程10天～20年。按组织学表现分为27例滤泡型(其中可见鳞状化生和颗粒变性区域的分别为21例和10例)和12例丛状型(其中2例见散在鳞化细胞灶,1例见细胞颗粒变性)。Fas、FasL、caspase-3和bcl-2阳性染色分别见于35(89.7%)、34(87.2%)、24(61.5%)和20(51.3%)例成釉细胞瘤。各抗原表达的阳性率在两种不同组织学类型的成釉细胞瘤之间无显著性差异(表1)。Fas、FasL和caspase-3都以胞膜和胞浆着色为主,caspase-3阳性染色还可见于部分细胞核。肿瘤上皮岛中心的鳞状化生或颗粒变性灶均呈Fas中至强阳性表达(图1、2),而中心的星网状细胞及外周的基底细胞则大部分呈阴性;在细胞星网状分化不明显、上皮岛中心由紧密排列的梭形细胞构成的区域也可呈Fas阳性染色;FasL和caspase-3抗原表达的阳性强度较Fas弱,而阳性细胞的范围较弥散,鳞状化生及颗粒变性细胞的染色稍强,较多区域的中心星网状细胞和外周细胞亦呈弱阳性;bcl-2为胞浆着色,阳性细胞主要是肿瘤上皮岛外周的基底细胞(图3),仅见少部分星网状细胞呈阳性染色,鳞状化生灶和颗粒变性细胞不表达bcl-2。统计学分析显示,成釉细胞瘤中四种不同分化或变异程度的细胞成份之间,Fas、caspase-3和bcl-2表达的阳性强度均有显著性差异,而FasL的表达无显著性差异(表2)。Fas和caspase-3(Spearman相关系数为0.428,P=0.007)的阳性率之间呈正相关关系;而caspase-3和bcl-2的阳性率呈负相关关系(Spearman相关系数为-0.349,P=0.030)。38例(97%)成釉细胞瘤可见肿瘤细胞的细胞核呈Ki67阳性染色,主要集中于上皮岛周边的基底细胞,偶见中心星网状细胞阳性,呈鳞状化生及颗粒变性的肿瘤细胞为阴性。11例成釉细胞瘤中10例可见凋亡细胞,但一般数量较少,主要见于发生鳞状化生或颗粒变性的区域(图4)。fas在肿瘤中的表达细胞凋亡是由多基因严格控制的过程,细胞凋亡的启动可由多种细胞内外信号引起,并且可能存在多种不同的死亡信号转导通路,目前研究较多的Fas/FasL膜受体通路可引发细胞凋亡。Fas是一种跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,当与其配体FasL(肿瘤坏死因子超家族成员)结合后,引发一系列细胞内蛋白募集及酶激活的级联反应,最终激活caspase-3,其作为细胞凋亡的效应酶,分解各种细胞内物质,最后形成凋亡小体,被其他细胞吞噬而被清除。Fas/FasL介导的细胞凋亡机制的异常可能在多种肿瘤的发生、发展过程中起作用,并可能影响肿瘤的治疗及预后。本研究发现35例(89.7%)成釉细胞瘤表达Fas,上皮岛中心发生鳞状化生和颗粒变性的细胞表达较强,星网状分化不明显而呈梭形、排列紧密的中心细胞也呈Fas阳性。Muraki等通过免疫组化方法发现Fas在白斑的角化部位及高分化鳞状细胞癌中表达较强,认为Fas的表达可能与角化的病变有关。Kumamoto等的研究显示成釉细胞瘤中的角化细胞和颗粒细胞为Fas强阳性,而在基底细胞型成釉细胞瘤中Fas为阴性或弱阳性。这些结果提示Fsa的表达可能与肿瘤细胞的分化程度有关。本研究还发现FasL在34例(87.2%)成釉细胞瘤中呈阳性表达,阳性较强的部位与Fas基本一致,但其表达强度在四种不同分化或变异程度的肿瘤细胞之间无显著性差异,提示成釉细胞瘤中可能存在FasL的自分泌机制,肿瘤细胞产生的FasL与Fas阳性细胞结合并引发凋亡。本研究中24(61.5%)例成釉细胞瘤表达caspase-3,作为Fas/FasL介导的细胞凋亡通路上的效应酶,其阳性较强的部位与Fas一致,但总体阳性率及阳性强度较Fas低,阳性范围较弥散。除实验本身的干扰因素需考虑外,这种差异还可能由以下因素造成:caspase-3合成的增加与Fas的表达不一定同步;凋亡信号传导过程中的一些抑制因子发挥了作用,如bcl-2,本研究也发现caspase-3与bcl-2的阳性率呈负相关;另外,还可能有不依赖于caspase-3激活的Fas/FasL凋亡机制存在。bcl-2一般在处于未分化状态、增殖活跃、发挥干细胞作用的细胞中表达,其作用是抑制细胞的凋亡。本研究中20例(51.3%)成釉细胞瘤表达bcl-2,阳性细胞大部分为上皮岛周边的基底细胞,与增殖细胞标记Ki67的表达和分布一致。本研究采用TUNEL法证实,大多数成釉细胞瘤中的凋亡细胞数量较少,其分布主要集中于鳞状化生和颗粒变性区域,与促进凋亡的蛋白Fas、FasL和caspase-3的表达和分布是一致的。Sandra等曾提出成釉细胞瘤中可能存在两个明显不同的细胞亚群,即上皮岛外周的抗凋亡的增殖亚群和上皮岛中心的促进凋