响应面法优化锁阳黄酮超声提取工艺

响应面法优化锁阳黄酮超声提取工艺

cyboryltra俗称“老药”，也被称为羊咬不拉。它是锁阳科的一种多年生生长草本植物，通常生长在锁阳科的白刺科。是所有寄生虫的后代。近年来,锁阳的保健价值已被广泛重视,化学成分被逐步揭示,且对其生理、药理作用也有了更广泛的认识。目前,有关锁阳总黄酮提取方法的报道较多,其中超声提取优于其他传统方法,但均未对超声条件进行筛选。因此,为考虑各因素对锁阳黄酮提取率影响的变化规律及交互作用,本实验采用超声提取法通过单因素试验和响应面分析优化实验,以期获得锁阳黄酮超声提取的最佳工艺。为合理开发锁阳植物资源和药材质量控制提供科学依据,为进一步的化学成分分析和药理活性研究作基础。1实验材料1.1天麻的定义KQ-600DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);AB104-N电子天平(Mettle-Toledo);CARY50ProbeUV-Visiblespectrophotometer(VARI-ANAustraliaRTYLTD),Exceed-Da-20型艾柯纯水仪(成都康宁实验纯水仪器厂)。1.2无水乙醇、亚硝酸、微量元素铝的含量测定芦丁(国药集团化学试剂有限公司,批号:F20080313,纯度95%);无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝等均为分析纯,实验用水为超纯水,由纯水仪制得。锁阳由甘肃省瓜州亿得生物科技有限公司提供。2实验方法和结果2.1黄酮含量测定：样品溶液2.1.1具塞试剂的制备精密称取芦丁对照品25.3mg,以50%乙醇(水浴微热或超声)溶解并定容至100mL,得对照品储备液。精密吸取对照品储备液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL分别置于10mL具塞试管中,加50%乙醇使为5mL。各精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL,摇匀,放置6min;再各精密加入10%硝酸铝0.3mL,摇匀,放置6min;加4%氢氧化钠4mL,最后用50%的乙醇定容至10mL,放置15min以试剂空白于510nm处测吸光度。以吸光度对芦丁浓度进行线性回归,得回归方程:Y=11.66X+0.0001(R=0.9996)。2.1.2锁阳提取液的制备精密称取锁阳粉末1.0000g,以不同的乙醇浓度、提取次数、超声功率、料液比、提取温度及超声提取时间为因素,制得锁阳提取液。精密吸取样品溶液5mL,用“标准曲线的制备”项下方法测定吸光度,计算总黄酮提取率。2.2单因素研究和结果2.2.1乙醇浓度对锁阳总黄酮提取率的影响在提取2次,提取功率540W,料液比1∶30,提取温度75℃,超声提取时间1h条件下,考察乙醇浓度对锁阳总黄酮提取率的影响(图见1)。实验数据表明,乙醇浓度从30%增加到70%的过程中,提取率逐渐增大,至70%时达最大值,随后减小,故选择乙醇浓度为70%。2.2.2超声提取次数的确定在乙醇浓度70%,超声功率540W,料液比1∶30,提取温度75℃,超声提取时间1h条件下,考察提取次数对锁阳总黄酮提取率的影响(见图2)。实验数据表明,提取次数从1次增加到2次,提取率升高幅度较明显,继续增加提取次数,提取率无明显的提高,故选择提取次数为2次。2.2.3超声功率的影响在乙醇浓度70%,提取2次,料液比1∶30,提取温度75℃,超声提取时间1h条件下,考察超声功率对锁阳总黄酮提取率的影响(见图3)。实验数据表明,超声功率在240W~600W时,提取率随超声功率的增大而升高,600W时提取率达到最高,故选择超声功率为600W。2.2.4料液比对锁阳总黄酮提取率的影响在乙醇浓度70%,提取2次,超声功率600W,提取温度75℃,超声提取时间1h条件下,考察料液比对锁阳总黄酮提取率的影响(见图4)。实验数据表明,料液比(g:mL)在1:6~1:30范围内,提取率逐渐增大,之后随料液比的继续增大而略有下降,故选择提取料液比为1∶30。2.2.5提取温度对锁阳总黄酮提取率的影响在乙醇浓度70%,提取2次,超声功率600W,料液比1∶30,超声提取时间1h条件下,考察提取温度对锁阳总黄酮提取率的影响(见图5)。实验数据表明,提取温度从50℃升高75℃过程中,提取率也随之逐渐增大,在75℃时达最高值,而后随温度的继续升高而略有下降,故选定提取温度为75℃。2.2.6超声提取时间在乙醇浓度70%,提取2次,超声功率600W,料液比1∶30,提取温度75℃,考察超声提取时间对锁阳总黄酮提取率的影响(见图6)。实验数据表明,超声提取时间从30min增加到60min,提取率增大,而后随时间的继续增加反而下降,故选择超声提取时间为60min。2.3试验计划和结果2.3.1黄酮提取率测定通过Design-Expert软件,根据Box-benhnken的中心组合试验设计原理,综合单因素考察结果,选取乙醇浓度(X1)、料液比(X2)、提取温度(X3)、超声提取时间(X4)四个因素,以总黄酮提取率(Y)为衡量指标。采用四因素三水平的响应面分析方法进行试验设计,分析因素与设计见表1,试验设计方案与结果见表2。2.3.2方差分析及信度分析利用Design-Expert软件对所得数据进行回归分析,各因素经回归拟合后,得回归方程为:Y=28.50-0.0079X1-0.053X2+1.9X3+0.70X4-1.22X1X2-0.64X1X3-0.091X1X4-0.39X2X3+1.04X2X4-0.11X3X4-1.83X12-1.64X22-2.60X32-2.87X42。对优化后的回归模型进行方差分析及可信度分析(见表3)。结果显示,该模型显著(P<0.0001)且R2=0.9945,表明该模型拟合较好;变异系数(C.V.%)为1.00%,说明实验有良好的稳定性。综合分析表明可用此模型来分析和预测超声提取锁阳总黄酮的工艺结果。方差分析结果表明,提取温度和超声时间对锁阳总黄酮提取率影响显著,而乙醇浓度和料液比的影响较小,得到各因素的主效应关系为:提取温度>超声提取时间>液料比>乙醇浓度。2.3.3提取时间的影响为了更直观的观察其中两个因素同时对总黄酮提取率的影响,进行降维分析,利用多元回归方程可以得到不同因素对提取率率影响的响应面及其等高线图(见图7~9)。由响应面图可知,响应面开口向下,随着每个因素的增大,响应值增大,当响应值增大到极值后,随着因素的增大,响应值逐渐减小。该模型有稳定点,且稳定点是最大值。比较三组图可得:超声提取时间对黄酮提取率的影响较为显著,表现为曲线较陡(等高线排列密集),提取时间最佳值在63min附近,而乙醇浓度与料液比对黄酮提取率的影响不大,表现为曲线较为平滑(等高线排列疏松),随其数值的增加或减少,响应值没有显著性变化,其最佳值分别在70%和1∶30左右。从等高线图可以看出,乙醇浓度与料液比、料液比与超声提取时间之间的交互作用显著;而乙醇浓度与超声提取时间之间的交互作用不显著。说明乙醇浓度、料液比和超声提取时间对锁阳总黄酮提取率的影响不是简单的线性关系,平方项和交互项也有很重要的作用,这与方差分析结果相一致。分析图8可知:料液比与提取时间的等高线存在上升岭系统。料液比较小时,等高线相对比较平坦,提取时间对总黄酮得率影响不明显;料液比较大时,等高线排列密集,提取时间对总黄酮提取率的影响比较明显。且通过上升岭系统可以较快地到达提取率最优区域。说明两个因素之间存在互相促进作用,与回归方程中交互项X2X4的系数为正号相符。图7则刚好相反,说明乙醇浓度与料液比之间有一定的抑制作用。2.3.4最佳工艺条件的确定通过Design-Expert得最佳工艺条件为:乙醇浓度为69.64%,料液比为1∶30.01,提取温度为76.93℃,超声提取时间为61.75min,在此工艺条件下,提取率理论值可达28.918%。为检验响应面法的可靠性,同时考虑实际操作和仪器的局限性,将最佳工艺条件修正为:乙醇浓度70%;料液比1:30;提取温度77℃;超声提取时间62min。并进行重复验证实验,得锁阳总黄酮平均提取率为28.851%(RSD=2.07%,n=5),与理论值吻合较好,表明响应面法优化得到的提取工艺参数准确可靠,具有实用价值。3最佳工艺的确定超声波提取法由于操作简便快捷、提取温度低、提取率高、提取物的结构未被破坏等特点,甚至有时会比超临界萃取、微波萃取等现代提取方法效果更好,近年来已广泛用于植物有效成分的提取。响应面法集统计学、数学建模和计算机科学于一身,随着计算机的发展,它已成为精度高、应用广并具有实用价值的优化技术。本研究在单因素实验基础上,进行Box-Behnken中心组合实验设计,建立了超声提取锁阳总黄酮的工艺数学模型。回归分析表明,