宫颈组织中reg细胞和吲哚胺2,3-二氧酶的表达及其临床意义

宫颈组织中reg细胞和吲哚胺2,3-二氧酶的表达及其临床意义

人类乳头瘤病毒（hp）通过性传播被感染。70.90%的pv感染可以在1.2年内自行消除。一些感染患者仍然存在iv感染，导致环腺炎、宫颈皮炎和原位癌、润癌和转移癌的发生和发展。局部和全身免疫监视系统的变化,决定了HPV感染的持续时间和是否发展为高级别病变,免疫逃逸在宫颈癌的发生发展中发挥了重要作用。近年来,人们发现,具有免疫调节功能的吲哚胺2,3-二氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO),可能与肿瘤免疫逃逸有关,IDO通过阻断T细胞和NK细胞的活性来抑制免疫反应,人类多种肿瘤组织和器官中可出现不同程度IDO表达。近期研究表明,在多种人类肿瘤中,CD4+CD25+Treg细胞参与抑制免疫反应,与肿瘤免疫逃逸密切相关,在宫颈癌的间质和上皮组织中表达增强,参与疾病的发生。本文检测HPV感染相关宫颈疾病(宫颈炎、CINⅠ~Ⅲ、宫颈癌)中Treg细胞和IDO表达的变化,初步探讨Treg细胞和IDO在宫颈癌进行性发生发展中的意义。1材料和方法1.1纳入研究对象的范围和排除条件选择2009年7月~2011年2月我院收治的194例女性患者,平均年龄为(42.2±3.8)岁,其中包括子宫肌瘤行全子宫切除患者,其正常宫颈组织作为正常对照组。32例(16%)为正常宫颈组织,30例为宫颈炎(15%),60例(31%)为CINⅠ,27例(14%)为CINⅡ,21例(11%)为CINⅢ,24例(12%)为宫颈癌。除正常对照组,其他组患者均行HPV检测、宫颈TCT检查,对照组和实验组均行宫颈病理学检查,根据HPV高危型检测结果和组织学结果,按病变程度分为正常宫颈(对照组)和HPV阴性(HPV-)宫颈炎、HPV阳性(HPV+)宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌6组实验组。纳入研究患者应排除以下条件:绝经期妇女、妊娠、慢性疾病(糖尿病、过敏、自身免疫性疾病)、急性感染、口服避孕药、曾接受过放化疗及免疫治疗,合并其他脏器肿瘤。HPV检测:宫颈组织样本收集后送医院检验科检测。1.2实验方法1.2.1样品采集宫颈组织一部分用于病理检查,一部分制成单细胞悬液用于细胞和IDO的检测。细胞溶解于Trizol,RNA分离参照说明书进行。1.2.2引物的合成及测序从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核酸数据库(EntrezNucleotidesdatabase)中检索,应用设计软件Primer5.0进行引物设计,然后将设计出的引物输入BLAST数据库中进行同源性比较,最终得到特异的引物序列。所有引物均由上海赛百胜生物公司合成。设计出的引物序列如下:IDOsenseprimer:5’-TTTGCTAAAGGCGCTGTTGG-3’,IDOantisenseprimer:5’-CCTTCATACACCAGAC-CGTCTGA-3’;GAPDHsenseprimer:5’-ACAACAGC-CTCAAGATCATCAG-3’,GAPDHantisenseprimer:5’-GGTCCACCACTGACACGTTG-3’。1.2.3总rna提取RNA的提取和逆转录合成CDNA宫颈组织使用微量RNA提取试剂盒(QIAGEN)提取总RNA,具体操作步骤按试剂盒说明书进行。用MBI逆转录试剂盒进行逆转录反应,反应体系为20μl,全过程在冰上进行。1.2.4循环循环的计算实验中Q-PCR所用染料为SYBRGreen。反应条件均为95℃12min,然后95℃15s,60℃60s,共45个循环。以GAPDH的表达量作为内参照。采用SYBRGreen试剂,可通过每一个PCR扩增反应中循环产物的荧光信号强度进行实时检测,从而记录产物量。1.2.5大鼠抗体检测将收集的宫颈组织单细胞悬液计数,每样本细胞数应达到1×106个。检测Treg细胞,加入鼠抗人CD4-FITC单克隆抗体、鼠抗人CD25-PE单克隆抗体、鼠抗人CD127-ACEXA647单克隆抗体,室温孵育30min。处理好的样品应用流式细胞仪常规进行分析,以相应的荧光标记的同型对照IgG1染色细胞作为阴性对照,应用EXPO2软件分析结果。1.3统计学分析采用SPSSFORWINDOWS16统计软件进行统计学分析,数据以均数±标准差表示,采用t检验进行统计学处理,并采用秩和检验进行两两比较。2结果2.1hp检测结果5组患者HPV检测结果见表1。2.2阴道各组患者ctreg细胞占cd4+t细胞比例的比较宫颈癌、CINⅢ、CINⅡ及CINⅠ组中,均选择HPV高危型(+)的患者进行Treg细胞表达检测,宫颈炎患者分为HPV(+)宫颈炎和HPV(-)宫颈炎组。统计学分析结果显示,宫颈癌组中Treg细胞占CD4+T细胞比例为(10.3±2.1)%,高于CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宫颈炎组[(7.7±1.6)%、(7.2±1.5)%,(6.8±1.3)%和(7.5±1.5)%],前5组患者又高于HPV(-)宫颈炎组及对照组[(4.1±0.8)%和(4.7±1.0)%],P均<0.05,有统计学意义,CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宫颈炎组间比较无明显差异,见图1。2.3cin、pv+宫颈炎及hp-宫颈炎检测结果宫颈癌组宫颈组织中IDOmRNA表达水平为(1.72±0.28)×103拷贝,高于CINⅢ及CINⅡ组[(1.13±0.24)×103和(1.21±0.19)×103拷贝],这3组结果高于CINⅠ、HPV(+)宫颈炎、HPV(-)宫颈炎及对照组[(0.75.±0.09)×103、(0.68±0.10)×103、(0.71±0.08)×103和(0.62±0.09)×103拷贝],CINⅠ、HPV(+)宫颈炎、HPV(-)宫颈炎及对照组间无明显差异,见图2。3免疫组织ido表达水平在cin.肿瘤在发生、发展过程中会演化出种种逃避免疫监视的方式,导致宿主不能有效清除肿瘤而发生耐受,肿瘤诱导免疫耐受的机制目前尚未完全阐明。近年来在肿瘤组织中发现肿瘤浸润区域IDO高表达,造成局部微环境中色氨酸耗竭,同时伴有局部淋巴细胞中存在着Treg细胞水平增高的现象,两者相互作用与影响,导致肿瘤细胞逃避免疫细胞的监视,IDO和Tregs的出现为研究肿瘤免疫耐受的机制提供了一个新的方向。IDO是色氨酸的犬尿素分解代谢途径的限速酶,能在多种细胞特别是一些涉及调节免疫反应关键步骤细胞的细胞质中表达,通过分解代谢色氨酸抑制免疫细胞功能,是机体免疫耐受功能的重要调节因子。组织局部微环境中色氨酸的耗竭对T细胞具有免疫调节作用,可能是肿瘤微环境中免疫耐受形成过程中的一个关键因素。Uyttenhove等发现人类多种肿瘤如肺、前列腺、胰腺等器官的肿瘤组织可出现不同程度IDO表达。Karanikas等观察到各种类型肺癌肿瘤组织中IDO表达显著高于邻近正常肺组织。本研究中显示SCC组宫颈组织中IDOmRNA高于CINⅢ及CINⅡ组,这3组结果高于CINⅠ、HPV(+)宫颈炎、HPV(-)宫颈炎及对照组,CINⅠ、HPV(+)宫颈炎、HPV(-)宫颈炎及对照组间无明显差异。说明随着病情进展,即从宫颈炎、CINⅠ到CINⅡ、CINⅢ,再发展为宫颈癌,组织中IDO表达水平逐渐增高,提示随着宫颈病变进展,肿瘤组织已逐步建立起有利于肿瘤发展的免疫逃逸机制,可能通过表达IDO成功逃避机体免疫攻击,使疾病发生发展。原因可能与IFN-γ能在转录水平诱导IDO基因表达有关。由于HPV感染的肿瘤细胞诱导机体产生IFN-γ,随病情的进展及肿瘤坏死和局部炎症反应,肿瘤及周围组织IFN-γ浓度逐渐增高,从而诱导肿瘤细胞、宿主APCs细胞及肿瘤组织中其他浸润细胞表达IDO,使肿瘤细胞逃避机体免疫攻击加速疾病进展。恶性肿瘤局部浸润了各种免疫细胞,但是这些免疫细胞并不能有效清除肿瘤细胞,肿瘤局部浸润的免疫细胞中有部分可能是充当免疫负调节的角色,Treg细胞正是具有这一特性的免疫细胞,在肿瘤细胞免疫耐受以及肿瘤的发生、发展中起到重要作用。动物实验研究表明去除实验动物的Tregs可以提高抗肿瘤特异性反应,有研究表明在CIN及宫颈癌患者外周血单核细胞或CD4+T细胞中Treg细胞比例增加,如果清除CD25+T细胞能提高HPV16E6和E7特异性辅助T细胞反应,表明内在的抗HPV反应存在。本文研究显示宫颈癌患者宫颈组织中Treg细胞占CD4+T细胞比例分别高于CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宫颈炎患者;宫颈癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宫颈炎这5组患者Treg细胞比例高于HPV(-)宫颈炎及正常宫颈组织组患者。前期研究结果显示,CIN病变患者宫颈组织中Treg细胞数增加,并随病变程度的加重呈渐进性增加,而本文研究表明,HPV阳性的CINⅠ~Ⅲ及宫颈炎患者中,Treg细胞比例无明显差别,这与前期的研究有所出入。但是,前期研究中的CINⅠ~Ⅲ组患者包括HPV(+)和HPV(-),而本研究的CINⅠ~Ⅲ组患者仅仅为HPV(+),本文研究结果更能客观说明高危型HPV感染持续存在,Treg细胞数增加,与宫颈病变的发生发展密切相关。IDO表达与局部浸润的Tregs细胞间存在相关性,即IDO高表达伴随着局部浸润Tregs比例增高,这在多个肿瘤或动物模型中已有报道。IDO和Tregs间存在着一个类似于正反馈的调节环路,共同介导肿瘤的免疫耐受。然而Thuere等却提出Tregs只在母体蜕膜上出现,而IDO则在胎盘上表达,同时Tregs在妊娠早期即出现,而IDO在妊娠8天之后才表达,因此,Treg可能不是诱导IDO表达的原因,这为IDO与Tregs间相互关系的研究提出了新的挑战。本文研究结果显示,在HPV感染相关宫颈疾病的不同阶段进展