grp79、cr、erp57蛋白与hpv16型感染在维吾尔族和汉族妇女中的表达及相关性分析

grp79、cr、erp57蛋白与hpv16型感染在维吾尔族和汉族妇女中的表达及相关性分析

hp感染是子宫颈癌的主要原因，尤其是hp16。而MHC-Ⅰ类分子是介导T细胞免疫,处理病毒相关抗原的关键分子。有研究证实90%的子宫颈癌组织细胞表面MHC-Ⅰ类抗原表达缺失。机体抗肿瘤的效应细胞的激活主要是通过钙网蛋白(calreticutin,TCR)识别MHC-Ⅰ类分子及其呈递的内源性抗原肽所构成的复合体来进行;如果MHC-Ⅰ表达异常,导致对癌抗原提呈、识别和杀伤作用发生障碍,即肿瘤细胞抗原肽无法被识别,从而使HPV感染后受损伤的细胞逃脱免疫监视,发展为原位癌、浸润癌或转移等。研究发现,在癌前病变和癌变时,由于肿瘤细胞MHC-Ⅰ类分子和TAP蛋白的表达减少引起抗原提呈缺陷,从而不能有效的引发细胞免疫。因此有关于与MHC-Ⅰ类分子相关蛋白的研究就十分重要。目前,关于子宫颈癌组织中这3种蛋白在维吾尔族与汉族之间表达的相关文献报道在国内外的研究尚未见报道,故该实验主要为了研究葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein78,GRP78)、CRT、ERP57(GRP58)蛋白在维、汉子宫颈癌中的表达情况,以及与HPV16感染在维、汉子宫颈癌中的相关性。1材料和方法1.1试剂与pcr收集2002～2007年间新疆医科大学第一附属医院及喀什地区人民医院子宫颈炎组织69例,其中汉族38例,维吾尔族31例;子宫颈癌124例,汉族36例,维吾尔族88例。免疫组化试剂柠檬酸抗原修复液(pH6.0),Mayer苏木精复染液,二抗试剂盒和DAB显色试剂盒(均购自于北京中杉金桥公司),一抗GRP78(美国SANTA公司,1∶100)、CRT(美国SANTA公司,1∶400)、ERP57(美国ABCOME公司,1∶150)。PCR所用试剂蛋白酶K、PCR试剂盒、DEPC处理水、琼脂糖、100bpDNALadderMarker购自大连宝生公司;5×TBE、1×TE、酚∶氯仿∶异戊醇(pH8.0)(25∶24∶1)、UNIQ-10纯化柱购自上海生工公司。1.2方法1.2.1胞质内质网表达免疫组化染色以细胞质或细胞核染成黄色或棕褐色为阳性判定标准。用光镜下检查显色反应,GRP78、CRT、ERP57均在胞质内质网表达,棕黄色颗粒为阳性细胞。根据阳性细胞在子宫颈上皮中所占面积分为5个等级:<5%为(-)、10%～25%为(+)、25%～50%为(++)、50%～75%为(+++)、>75%为(++++)。阴性对照为等量PBS替代一抗的子宫颈组织。1.2.2pcr扩增条件从10%福尔马林固定、石蜡包埋的组织中提取DNA,HPV16上游引物序列5′-GGTCGGTGGACCGGTCGATG-3′,下游引物序列5′-GCAATGTAGGTGTATCTCCA-3′,HPV16型基因组PCR扩增片段大小为96bp,PCR扩增条件为(95℃预变性3min,循环1次,95℃变性15s,60℃退火20s,72℃延伸25s循环40次,72℃7min循环1次,4℃保存),PCR总反应体积为50μl[TaKaRaExTaq(5U/μl)0.3μl、10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)5μl、dNTPMixture(每次2.5mmol/L)4μl、模板DNA5μl、引物1、2(20pmol/ml)2μl,加DEPC处理水至50μl]。1.3进行率的比较和关联性分析采用SPSS15.0统计软件,对计数资料用χ2检验进行率的比较和关联性分析。等级资料采用非参数秩和检验,相关性检验采用Spearman秩相关分析数据,运用列联系数表示。2结果2.1grp78、crt和ep57的蛋白GRP78、CRT、ERP57的阳性细胞胞质均呈棕黄色或棕褐色,少数细胞核偶见GRP78、CRT、ERP57棕褐色染色(图1～3)。2.2电泳wf将PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳(100V,10min;60V,1h),经GelDocEQ凝胶成像仪(BIO-RAD成像(图4)。2.3在子宫颈癌和子宫颈炎中，grp78、crt和ep57骨髓3grp钢在实体癌治疗及相关癌组织中的表达HPV感染是子宫颈癌的主要病因。尤以HPV16最突出(占HPV感染率40%～60%),属于高危型HPV。作为与介导抗病毒T细胞免疫相关的关键分子MHC-Ⅰ类分子,参与和调节机体免疫应答,决定疾病易感性的个体差异,肿瘤病毒感染相关。该实验是对这一系列的组装和负载过程中所参与的相关蛋白GRP78、CRT、ERP57进行的研究。郝治等报道新疆地区维吾尔族妇女子宫颈癌中HPV16的感染率达58.06%(36/62),并高于汉族妇女子宫颈癌中HPV16的感染率16.67%。海米提等报道中国新疆HPV16基因与该地区宫颈癌高发存在一定的联系。该研究中表明子宫颈癌中HPV16的感染率(31.45%)远高于子宫颈炎中HPV16的感染率(11.59%),差异具有统计学意义(P<0.05);而在民族之间比较时发现,新疆维吾尔族妇女子宫颈癌中HPV16的感染率达40.91%(36/88),远高于在汉族妇女子宫颈癌中的表达率8.33%(3/36)。这表明,新疆维吾尔族妇女对HPV16型病毒的易感性高于汉族。GRP78被认为是Hsp70家族的成员之一。GRP能调节蛋白的折叠与装配,并具有细胞保护作用,或是转录因子、细胞凋亡因子、葡萄糖载体作用。生理情况下,GRP78在真核生物内质网膜上通过与新生多肽以非共价键形式短暂地结合,随后松开,从而促进蛋白质的正确折叠和装配,并协助蛋白质跨内质网膜转运,将其转运到一定的位置;在实体肿瘤内,GRP78能转移内质网腔内的错误折叠蛋白,保持细胞在应激状态下蛋白质合成的继续,因此肿瘤细胞也存在GRP78的保护作用,GRP78可降低细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤力,促进肿瘤的生成和抗药性产生,防止肿瘤细胞凋亡。近期在对各种肿瘤组织标本的研究中均发现,GRP78的产生还可以减少肿瘤细胞的凋亡,GRP78的高表达与肿瘤恶性程度有关。刘荣华、刘艳红等报道,GRP78在乳腺癌及肝癌组织中呈高表达;Fernandez等观察到在恶变的乳腺癌组织中GRP78过度表达,而在良性病变中没有此种蛋白的表达。而Mario等在前列腺癌患者血清分离出抗GRP78抗体。张新晨等运用半定量RT-PCR显示胃癌组织与正常组织中GRP78的表达,结果显示,GRP78在胃癌中的表达高于正常组。该研究结果表明:GRP78在子宫颈癌中的阳性表达率(95.16%)高于宫颈炎组(86.96%),差异有统计学意义(P<0.05)。在子宫颈癌中,GRP78的表达与HPV16的感染存在正相关关系(r=0.278,P<0.05)。同时,GRP78在汉族妇女宫颈炎中的阳性表达率(81.58%)与汉族妇女子宫颈癌组(100%)之间存在不同,差异有统计学意义(P<0.05)。由此说明,GRP78在子宫颈癌组织中呈高表达,并随着宫颈病变的发展呈增高趋势,这与Lee的研究报道一致,说明子宫颈癌导致的内质网应激条件下,使得GRP78的诱导和合成明显增加,降低了细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤力,使得肿瘤细胞逃离了免疫监视,从而减少了肿瘤细胞的凋亡,并且有可能通过影响凋亡效应器的作用来阻断化学药物引起的细胞死亡。Vilatoba等报道,GRP78在子宫颈癌中的高表达可能是由于子宫颈癌生长速度过快,导致局部缺氧、缺血、营养物质缺乏及毒物等原因使GRP78代偿性增多和内质网应激的发生所致,与本实验结果一致。结合本课题组前期研究结果分析:作为内质网分子伴侣,参与一系列MHC-Ⅰ类分子转配所需的重要因子的GRP78,起着促发α链于β2-MG结合总过程中提供能量的重要作用。杜靖等报道β2-MG在宫颈鳞癌组织中低表达,由于β2-MG的低表达,致使MHC-Ⅰ类分子在子宫颈癌中的表达下调,而这一连续动作的终止或下调,可能使得内质网中GRP78大量代偿性增多。CRT是一类可溶性并存在于内质网的热休克蛋白,具有多种生物学功能,包括参与肿瘤抗原提呈、血管的发生及细胞的凋亡等。多种肿瘤组织中CRT表达有明显的改变,并与肿瘤的发展及预后相互关联。Mancino等发现CRT能识别内质网中错误折叠的MHC-Ⅰ类分子重链。除此以外,CRT还能结合抗原肽,在内源性抗原加工途径中起增强抗原递呈作用,这可能是它致病机制之一。相反地,CRT通过增强抗原递呈,诱导抗原肽特异性CD8+T细胞反应。近年许多研究发现,多种肿瘤中CRT有量的改变,提示其可能作为一种新的肿瘤标记物,有利于协助肿瘤的早期诊断。Chiqnard等通过蛋白质组学方法分析得出,CRT在肝癌患者中的表达高于肝癌高危人群及正常人;Kageyama等用窄pH范围双向电泳法分析发现,膀胱癌变组织中的CRT高于正常组织;该学者还用CRT抗体检测CRT蛋白,以鉴定其敏感性和特异性,结果显示敏感性为73%、特异性为86%;Hsu等研究结果显示,47.1%的成神经细胞瘤患者CRT表达阳性,并且CRT的表达量与分化程度密切相关。该研究结果表明:CRT蛋白在子宫颈癌中的阳性表达率(90.32%)均高于宫颈炎组(50.72%),差异有统计学意义(P<0.05),这与上述学者的研究结果报道一致。在子宫颈癌组织中,CRT在子宫颈癌中的表达与HPV16的感染存在正相关关系(r=0.429,P<0.05)。鉴于CRT是MHC-Ⅰ类分子转配过程中CNX/CRT分子伴侣系统不可缺少的组成成分,结合杜靖等报道,由于CNX在子宫颈癌中的低表达致使MHC-Ⅰ类分子在子宫颈癌中的表达下调,而这一连续动作的终止或下调,可能使得内质网中CRT大量代偿性增多。综上所述,CRT可作为制定治疗计划与评价预后的有用指标。以上这些研究可表明,CRT有望成为多种肿瘤的新标记物,协助早期诊断。ERP57又名葡萄糖调节蛋白58(glucoseregulatedprotein58,GRP58),被认为是蛋白二硫化物异构酶(PDI)家族成员之一。ERP57作为内质网内腔中的一种重要分子伴侣,在细胞内是以一种可溶形式存在,具有巯基依赖性氧化还原酶活性,是促进正常生长状态下细胞蛋白质的合成、维持细胞机能和生命的关键性调节物质。ERP57在真核生物内质网膜上通过自身的2个硫氧还蛋白结构域,以二硫键与新生多肽相结合,形成短暂的中间产物,然后分开,从而促进新生多肽的正确折叠和装配,并协助新生多肽跨内质网膜转运,将其转运到指定的位置。因此在MHC-Ⅰ类分子表达缺失的肿瘤中,ERP57的表达有助于诱导肿瘤细胞的发展。Celli等研究发现,ERP57在乳腺癌、子宫癌、肺癌和胃癌中均较对应的癌旁组织表达上调;反过来,肿瘤细胞的大量增殖,也促进ERP57表达的增加。在正常大鼠肾脏细胞转入病毒致癌基因转化子后,研究者发现ERP57的蛋白水平升高。该研究结果表明:ERP57蛋白在子宫颈癌中的阳性表达率(90.32%)均高于子宫颈炎组(49.28%),差异有统计学意义(P<0.05),ERP57蛋白在子宫颈癌中呈高表达。在子宫颈癌组织中,ERP57的表达与HPV16的感染存在正相关关系(r=0.222,P<0.05)。但是通过在民族之间进行比较时我们发现,ERP57蛋白在汉族妇女宫颈炎中的阳性表达率(60.53%)高于维吾尔族宫颈炎组(35.48%),差异有统计学意义(P<0.05)。这说明ERP57在子宫颈癌组织中呈高表达趋势,作为参与一系列MHC-Ⅰ类分子转配所需的重要因子,ERP57在构成CNX/CRT分子伴侣系统过程中是不可或缺的组成成分。杜靖等报道,由于CNX在宫颈癌中的低表达致使MHC-Ⅰ类分子在宫颈癌中的表达下调,而这一连续动作的终止或下调,可能使得内质网中ERP57大量代偿性增多。而进入宫颈癌时期,ERP57在汉族子宫颈癌组织中