辣根素生物活性研究进展

辣根素生物活性研究进展

辣根素是指从碱性根系中提取的原生代谢产物，如甘草、b.mey、etschrb等。化学结构中的含量为-n.c.s，在室温下可蒸发，外观如油状液体。辣根素的主要成分为异硫氰酸酯类化合物(isothiocyanates,简称ITCs),其中含量较高的为烯丙基异硫氰酸酯(allylisothiocyanate,简称AITC)。由于辣根素生物活性广谱,引起了诸多学者的广泛关注,本文就国内外有关辣根素的生物活性研究报道进行归纳和总结。1辣根素的抗肿瘤活性辣根素在医学领域的研究主要涉及基因毒性、抗肿瘤和抗癌活性。近30年来,辣根素的抗肿瘤活性一直是研究的热点。辣根素中的相关化合物在癌症和恶性肿瘤的临床研究中呈现出良好的预防效果,这为其开发成临床药物奠定了良好的基础。1.1甲硫基苯己基itc的活性早在1989年,Wattenberg发现丁基ITC和戊基ITC可以抑制苯并芘及二甲基蒽等致癌物质诱发的胃癌和肺肿瘤的发生。Stephen等通过动物试验,发现一些ITCs确有防止胃癌、肺癌、乳腺癌及结肠癌等恶性肿瘤的功效。Ono等通过试验确认了6-甲硫基苯己基ITC的抗癌活性。随后,Fuke等将人体内分离出的胃癌细胞置于含有40μg·mL-1日本辣根Wasabiajaponica(日本山嵛菜EutrematenueMakino)粗提物的基质上培养,发现该癌细胞的形态会发生显著变化,同时有许多癌细胞死掉。同时发现天然存在于甘蓝和日本辣根中的甲硫基苯己基ITC能够抑制典型的致癌物质(PAHs,HAs和亚硝胺)所引起的皮肤细胞癌变。另外,甲硫基苯己基ITC还能抑制老鼠肿瘤细胞的生长。这些在哺乳动物上的研究为辣根素化合物开发为临床抗癌、抗肿瘤药物奠定了基础。1.2itcs的活性和基因毒性大量的研究结果表明:高剂量的ITCs(使用剂量高于100mg·Kg-1)具有基因毒性,会导致哺乳动物细胞姐妹染色体交换和染色体失常,从而引起脱氧核糖核酸损伤和致癌。Fekadu等通过大肠杆菌Escherichiacoli、沙门氏菌TA100/TA98Salmonella和人类HepG2细胞试验证实了AITC和苯基异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate,简称PITC)的基因毒性。在90~270mg·kg-1高剂量条件下,AITC在老鼠体内组织中显示出中等程度的基因毒性,而PITC在老鼠体内所有组织中没有明显的基因毒性。在进一步研究AITC和PITC基因毒性弱化的原因中,证实了老鼠组织匀浆、牛血清蛋白和人类唾液等环境中都能显著地削弱AITC和PITC的基因毒性。Mariko等研究了ITCs对c-Ha-ras-1原癌基因和人类P53抑癌基因的脱氧核糖核酸片断的损伤。其研究结果显示:浓度为100µg·mL-1以上的AITC、PITC和苄基异硫氰酸酯(benzylisothiocyanate,简称BITC)在Cu2+存在的条件下能够引起脱氧核糖核酸损伤,其损伤的部位通常在胸腺嘧啶和胞嘧啶处,激光显像密度计测试证实该点突变位于P53抑癌基因的273位ACG密码子,这个部位的序列发生改变会使P53失去正常的生物活性,并且AITC的损伤效果强于后两者;但在缺乏Cu2+存在的条件下,ITCs不会造成脱氧核糖核酸损伤。在人类骨髓性白血病HL-60细胞中,AITC能够诱导8-oxodG(脱氧核糖核酸氧化损伤的标志物)的生成,但在其抗双氧水的克隆细胞HP100中却不能,说明双氧水在ITCs诱导的细胞内脱氧核糖核酸损伤过程中扮演了关键角色。辣根素的使用剂量和作用机理是其在抗癌活性、抗肿瘤活性和基因毒性研究的症结点,这也可能是导致辣根素在临床上用作抗肿瘤和抗癌药物受限制的关键因素之一。辣根素毒理和药理学的基础数据为辣根素在农业领域的安全使用提供非常重要的参考价值。2辣根素对农业生物活性的研究2.1甲基异硫氰酸酯在仓储害虫应用中的作用仓储害虫长期生活在储藏物环境之中,由于种群的高密度繁衍对仓储环境表现出很强适应性,形成了独特的生物学特性。主要表现为个体小,能耐高温、低温,耐饥饿、抗干燥,食性杂,分布广,严重为害仓储物。由于仓储害虫种群繁殖的速度快,密度大,对仓储物造成的经济损失往往十分惊人,据美国农业部估计,20世纪60年代美国在农产品储藏和加工过程中,因害虫造成的损失约23亿美元。至今,全世界已定名的仓储害虫有533种,中国有仓储害虫383种,其中分布广、为害大的主要是玉米象、谷盗类、谷蠹、豆象类、麦蛾、印度谷螟等。近50年来,仓储害虫防治应用最为广泛的是溴甲烷和磷化氢,而溴甲烷在发展中国家于2015年以前必须全面禁止使用,与此同时仓储害虫对磷化氢的广泛抗性使得人们对新熏蒸剂的需求日益强烈。植物源熏蒸剂辣根素正是在这种背景下从植物中筛选并分离提纯出的植物性物质。但与此有关的一些研究内容早在上世纪九十年代就有零星报道,如陆安邦概述了法国人DucomV关于甲基异硫氰酸酯作为谷物熏蒸剂的报道:在温度为20℃条件下,甲基异硫氰酸酯在浓度时间积(CT)分别为4.5和12.5g·hm-3的空仓中,各虫期杂拟谷盗及白腹皮蠹成虫死亡率均为100%;在温度分别为10℃和20℃条件下,甲基异硫氰酸酯在浓度时间积(CT)为12.35g·hm-3空仓中,米象各虫期的死亡率均为100%。研究还发现熏蒸使用的初始剂量比熏蒸时间更重要。甲基异硫氰酸酯比其他熏蒸剂在谷物上的吸着量要大,然而对烘烤品质没有影响。对于各虫期杂拟谷盗及白腹皮蠹成虫死亡率均为100%,这是一个毒理学的数据,这个数据仅供参考,也说明甲基异硫氰酸酯在具体应用过程中其在浓度时间积(CT)有进一步下降的空间,当浓度下降时,其在谷物上的吸附量也将下降,这些指标都是甲基异硫氰酸酯在仓储害虫上具备应用潜力的有利条件。Liblikas等测试了9个异硫氰酸酯和硫氰酸酯类化合物对鞘翅目叶甲科的叶甲虫的敏感性应答。其测试的9个辣根素化合物分别为:烯丙基异硫氰酸酯,苄基异硫氰酸酯,3-丁烯基异硫氰酸酯,3-丁烯基硫氰酸酯,丁基异硫氰酸酯,丁基硫氰酸酯,2-苯乙基异硫氰酸酯,2-乙基硫氰酸酯、2-乙基醇。研究结果表明:丁烯基异硫氰酸酯和丁烯基硫氰酸酯对黄曲条跳甲有很强的引诱效果,而其它的异硫氰酸酯和硫氰酸酯则显示出较弱的引诱效果。Worfel等利用烯丙基异硫氰酸酯制作WasaOurosystem对仓储害虫进行了抑制效果的研究,结果显示,该体系既没有趋避也没有引诱烟草窃蠹Lasiodermaserricorne,但是减少了杂拟谷盗Triboliumconfusum活动性;AITC严重影响了烟草窃蠹和杂拟谷盗再生繁衍,从而减少谷物中有害昆虫的虫口密度。有关辣根素化合物对害虫的熏蒸、趋避、引诱活性之间存在剂量关系,大部分辣根素化合物在0.1µg·mL-1以上对害虫表现出很强的熏蒸活性,而极少部分辣根素化合物在浓度为0.01µg·mL-1以下表现出一定的引诱活性,而部分异硫氰酸酯类化合物在浓度为0.01~0.1µg·mL-1范围内对部分仓储害虫呈现出既没有趋避也没有引诱活性。吴华等研究表明,辣根素原油(95%AITC)对玉米象、谷蠹、赤拟谷盗和书虱均有较好的熏蒸生物活性,且比常规的熏蒸剂磷化铝的处理剂量要低。在此基础上,吴华利用辣根素油剂(20%AITC)在集装箱和大型国有粮库的空仓和实仓中进行了熏蒸处理。结果表明,当AITC的浓度为5~10g·m-3时,能有效处理空仓中的有害生物;当AITC的浓度为30~50g·m-3时,能将实仓为一般虫粮的仓储降低至基本无虫粮的水平,并且AITC在粮食中的残留量随粮食贮藏堆积的高度不同而有所差异。上述研究结果充分表明,辣根素是具有开发前景的植物源熏蒸剂物质,但是有关辣根素在粮食上的吸附、残留、降解动态是值得深入研究和探讨的问题。2.2itcs的抑菌效果在最近的十几年里,研究人员对十字花科植物的次生代谢产物ITCs的杀菌谱进行了广泛的研究。陈古荣等研究表明,山嵛菜的有效成分ITCs在浓度为0.128g·mL-1时,对痢疾杆菌有显著性的抑制作用。Angus等将甘蓝和芥末的植物组织深翻至小麦田的方法用来控制小麦真菌全蚀病,其试验结果表明,小麦全蚀病能够被甘蓝(主要降解产物为甲基异硫氰酸酯)和芥末(主要降解产物为苯乙基异硫氰酸酯)有效抑制。在室温条件下,辣根素(主要活性成分为ITCs)具有很强的抑菌活性,当辣根素的浓度为200ng·L-1时,即可完全抑制黄霉菌、青霉菌、灰葡萄孢霉的菌丝生长,并能杀死霉菌孢子;当辣根素的浓度为300ng·L-1时,即可完全抑制莴苣中的假单孢菌。部分芳香类和脂肪烃辣根素类化合物对病原真菌表现出良好的生物活性,Mari等分别测试了辣根素类化合物苯基异硫氰酸酯、丁烯基异硫氰酸酯、2-苯基乙基异硫氰酸酯、4-甲硫基丁基异硫氰酸酯和烯丙基异硫氰酸酯等对念珠菌Monilinialaxa孢子萌发与菌丝体生长的抑制效果,结果表明,供试的五种化合物在较低的浓度下(0.1~2.0mgL-1)能够显著抑制念珠菌的孢子萌发与菌丝体生长。Smolinska分别测试了烯丙基异硫氰酸酯、乙基异硫氰酸酯、丁基异硫氰酸酯、2-苯乙基异硫氰酸酯、苄基异硫氰酸酯和苯基异硫氰酸酯等对尖镰孢菌Fusariumoxysporum厚垣孢子萌发的影响,研究结果表明,烯丙基异硫氰酸酯和乙基异硫氰酸酯能够完全抑制尖镰孢菌厚垣孢子的萌发。ITCs对多数植物土传病原菌也有较好的抑制效果。通过对病原菌抑菌试验证实,ITCs可以有效地抑制黑胫病豌豆根腐病Aphanomyceseuteiches、油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeriamaculans、小麦根腐病Bipolarissorokiniana、畸雌腐霉Pythiumirregulare和立枯丝核菌Rhizoctoniasolani等土传病原菌的菌丝的生长,抑制寄生霜霉Peronosporaparasitica、灰霉菌Botrytiscinerea和内生菌根菌Glomusmossae等病原菌的孢子萌发。ITCs不仅对土传病原菌有抑制作用,对于水果储存期易感染的病原菌也有抑制效果。Maria等对储存期梨的病原菌进行了熏蒸,发现ITCs对青霉Penicilliumexpansum、匍枝根霉Rhizopusstolonifer和梨形毛霉Mucorpiriformis都有较好的防治效果。Troncoso等将烯丙基,苄基,2-苯基乙基,苯基异硫氰酸酯按照1:3.5:5.3:9.6的比例(甘蓝菜中ITCs的比例)混合后,用浓度0.03mg·mL-1的ITCs即可100%防治柿子黑斑病Alternariaalternata(Fr.)Keissler,浓度0.56mg·mL-1的ITCs比市售的杀菌剂效果要好。Wu等将烯丙基ITC和乙基ITC按照3:1的比例混合后能够有效抑制苹果青霉病菌和灰霉病菌,组合物比单独使用AITC或EITC的使用剂量显著降低。ITCs不仅对病原真菌有较好的防治效果,对于病原细菌熏蒸生物活性也有零星报道。一般说来,革兰氏阴性菌要比革兰氏阳性菌对ITCs敏感,部分微生物通过降解其抑制物而对ITCs表现出较高的抗性。辣根素对微生物种群良好的生物活性,不仅可以在许多包装的食品中用作食品添加剂,还可以将其用作环境灭菌的消毒剂,同时还可以将其用作贮藏品的防腐保鲜剂,而与之相对应的辣根素缓释剂剂型的配套研究将对辣根素在杀菌方面的综合开发与利用具有十分重要的作用。2.3辣根素的模拟辣根素对线虫也表现出较好的熏蒸活性,不同的ITCs对爪哇根结线虫Meloidogynejavanica、根结线虫Meloidogyneincognita、胞囊线虫Heteroderaschachtii和奇氏根结线虫M.chitwoodi等都有较高的生物活性。Qing等报道了AITC对黄瓜根结线虫M.incognita、花生根结线虫M.hapla、甜菜胞囊线虫H.schachtii、大豆胞囊线虫H.glycines、短体线虫Pratylenchusneglectus、秀丽小杆线虫Caenorhabditiselegans和迁徙线虫Pratylenchuspenetrans六种根结线虫的室内生测活性结果,其LC50分别为17.0、24.1、30.8、14.9、16.0、10.3和20.3µg·mL-1。Zasada等研究了烯丙基、苄基、丁基、乙基、甲基、苯基、4-甲硫基丁基和2-苯基乙基异硫氰酸酯对爪哇根结线虫Tylenchulussemipenetrans和柑橘根结线虫Meloidogynejavanica的室内生物活性,测定结果表明在相同浓度下,AITC对爪哇根结线虫(LC90值为0.04µmol·mL-1)、苄基异硫氰酸酯对柑橘根结线虫(LC90值为0.06µmol·mL-1)熏蒸效果最好。在田间小区试验中,供试的大部分辣根素化合物均对根结线虫表现出了良好的防治效果,但辣根素化合物对不同种类线虫的防治效果具有一定的差异。Mark等研究了芸薹属植物不同部位对短体线虫Pratylenchusneglectus的防效,其结果显示,该属植物的根部对短体线虫的防治效果并不明显,但其叶片对短体线虫的防治效果可以达到56.2%~95.2%。Goswami等利用芥末油籽饼与呋喃丹混合能够很好地防治番茄根中感染的M.incognita根结线虫,其芥末油籽饼中的有效成分也为异硫氰酸酯类化合物。Wu等系统测试了15种ITCs对黄瓜根结线虫的生物活性,其中有6种ITCs对黄瓜根结线虫表现出了强烈的熏蒸活性,以AITC和丙烯酰基ITC最为优异,在田间条件下,两者在使用量为1.0kg·ha-1时,均能有效控制黄瓜根结线虫。由于根结线虫常年寄生在土壤和植物根系组织,一般的药剂很难直接作用于根结线虫,根结线虫的防治也一直是困扰研究人员和农业生产的难题,根结线虫也因此有“植物癌症”之称。辣根素中的部分化合物对根结线虫在田间应用中表现出较高的防效,这为辣根素作为土壤熏蒸剂的开发奠定了基础。但在田间的实际应用过程中,由于辣根素具有很强的刺激性,无论是灌根,喷雾还是滴灌,操作者都不方便使用,并且不同的施用方法其有效剂量的控制也比较困难。因此,辣根素土壤熏蒸剂的剂型、施用剂量及其在土壤中的持效期都是辣根素土壤熏蒸亟待解决的关键和核心问题。2.4植物种子萌发辣根素除了能有效抑制微生物的生长以外,对部分杂草也有防治效果。芳香类的ITCs能够抑制臭甘菊MatricariainodoraL.、绿穗苋AmaranthushybridusL.、稗草Echinochloacrusgalli(L.)Beauv.和续断菊Sonchusasper(L.)Hill等杂草种子的萌发。Haramoto等综述了辣根素类似物(不同取代基的异硫氰酸酯)对杂草种子萌发的影响,其中甲基异硫氰酸酯、烯丙基异硫氰酸酯、苄基异硫氰酸酯对小麦TriticumaestivumL.、马唐Digitariasanguinalis(L.)Scop.、无臭小白菊MatricariainodoraL.、顺利藜AmaranthushybridusL.、稗草Echinochloacrus-galli(L.)Beauv、刺苦苣菜Sonchusasper(L.)Hill、封黑草AlopecurusmyosuroidesHuds.和绒毛叶AbutilontheophrastiMedic.表现出了强烈的抑制活性,大部分种子萌发都显著减少。吴华等测定了辣根素(AITC,95%)对几种杂草种子的萌发情况,发现当AITC在10μguf0d7mL-1浓度下,旱稗E.hispidula种子有82%不能萌发。AITC浓度为20μg·mL-1时,野燕麦AvenafatuaL、野苋菜A.spinosus和播娘蒿Descurainiasophia种子完全丧失发芽能力。Jason等在田间条件下直接让甘蓝油菜的组织腐烂能有效防治豇豆Vignaunguiculata作物种植地的田间杂草。而关于辣根素对杂草种子的生物活性以及以辣根素为母体开发新一代的除草剂还有待进一步的研究。3辣根素的应用展望从以上几个方面简述可以看出,各国学者对辣根素的生物活性研究已较为宽广,在对仓储害虫、病原微生物、根结线虫等方面的生物活性研究都较为深入,并且部分化合物都表现出了较高的生物活性,这充分表明辣根素是极具应用潜力的一类化合物。但总的来说,我们对这一类化合物的研究认识还不够深入,仍有不少问题亟待解决,如辣根素杀虫、杀菌作用机制还知之甚少,在生产加工、残毒、环境毒理和田间应用等方面的研究仍然还存有不少疑问,但用发展的观点来综合分析则可肯定,辣根素仍为一类极有前途的化合物。辣根素为一来自于自然界的天然产物,本身的特性可使其对环境造成污染的程度降到极小。辣根素的生产只需要通过水蒸气蒸馏及后续的纯化获得,一般的农药厂都可进行生产。辣根素的主要成分烯丙基异硫氰酸酯本身也是一种食品添加剂,对人较为安全,在环境中易于分解,所以使用后对环境造成污染的可能性很小,也不会明显影响局部的生态平衡而较适于综合防治的要求。从作用特性上来看,其属于速效型、高效型和低毒型。而这个正好与农药的发展方向相一致。随着现代化科技手段的逐步采用,对辣根素的生理、毒理、药理及作用机制方面进行深入研究,有希望发现其在医用、农用方面的新用途。尤其是可以利用辣根素在医药领域的理论研究基础作为指导,通