黄芪多糖对黄羽肉种内源性肉鸡免疫功能的影响

黄芪多糖对黄羽肉种内源性肉鸡免疫功能的影响

目前，广泛应用于医学临床养殖中的氟苯尼科（fol）用作抗菌药物。氟苯尼科具有良好的吸收能力、抗抗菌谱和广泛的体内分布、无残留或残留数量等优点，但作为一种抗凝剂，它具有一定的抗凝剂效果。Guan等(2011)研究表明,氟苯尼考可有效抑制口蹄疫抗体的产生。操继跃等(2003)研究发现,小剂量(50mg/L)氟苯尼考对新城疫抗体水平影响不显著,而中剂量(150mg/L)和高剂量(250mg/L)氟苯尼考对新城疫抗体产生有显著的抑制作用。黄芪多糖(Astragaluspolysaccharin,APS)是黄芪的主要活性成分,能促进T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞的功能及免疫器官的发育(Liu等,2012;Nejatian等,2013),具有一定的抗免疫抑制作用。Guo等(2012)研究表明,黄芪多糖能消除环磷酰胺的免疫抑制作用,显著促进T淋巴细胞增殖,提高IgG和IgM抗体水平。王丽莎等(2012)研究发现,黄芪多糖在一定剂量下对氟苯尼考诱导的免疫抑制小鼠有一定的保护作用。本研究通过对健康肉鸡饲喂高剂量的氟苯尼考,人工将其造成处于免疫抑制状态的肉鸡,随后在其基础日粮中添加不同剂量的黄芪多糖,探讨黄芪多糖对氟苯尼考诱导的免疫抑制肉鸡生长性能、肠道菌群及免疫功能的调节作用,拟解决临床中黄芪多糖在免疫抑制肉鸡上的应用效果及最适添加剂量,为黄芪多糖在肉鸡饲料添加剂与免疫增强剂中的开发与产业化应用提供重要的科学依据。1材料和方法1.1鸡il-10elisa检测试剂及标准试剂盒氟苯尼考购自北京中联华康科技有限公司;黄芪多糖购自桐庐新天地生物科技有限公司,纯度为70%。鸡新城疫活疫苗(LaSota株)购自辽宁益康生物股份有限公司;鸡IL-10ELISA检测试剂盒、鸡IFN-γELISA检测试剂盒均购自上海朗顿生物科技有限公司。健康1日龄快大型黄羽肉杂鸡购自广西大发禽业养殖有限公司。基础日粮购自黔东南新希望农牧科技有限公司(畅销501肉小鸡配合饲料用于1~21日龄肉鸡,畅销502肉鸡配合饲料用于22~42日龄肉鸡),日粮营养水平见表1。1.3室外教学实训基地的建设饲养试验于2013年10月13日至2013年11月23日在毕节职业技术学院校外教学实训基地进行。试验鸡自由采食、饮水,控制舍内光照、温度、湿度,适时通风,每天定时打扫鸡舍卫生并消毒,常规免疫接种,其他饲养管理均按肉鸡常规管理程序进行。1.4同一部位盲肠,制备工艺分别于14、28、42日龄从每个重复中随机选取5只试验鸡进行翅静脉采血,0.5mL/只,血液于37℃放置1h,4℃放置4h,4000r/min离心10min,收集上清,-20℃保存备用;采血完毕后颈静脉放血处死,无菌条件下解剖,无菌操作截取试验鸡的同一部位盲肠,无菌采集盲肠内容物,4℃保存备用;并分离胸腺、脾脏和法氏囊,剔除脂肪后称鲜重,计算胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数。1.5指标和方法的测量1.5.1平均日增重、平均日食性和损失料量的测定分别于肉鸡7、14、28、42日龄以重复为单位对空腹(自由饮水)12h后的试验鸡称重,并准确称量和记录日供料量、剩余料量和损失料量,计算各阶段平均日增重、平均日采食量和料重比。1.5.2培养基培养方法将无菌采集的盲肠内容物用灭菌生理盐水依次进行10-1至10-10倍系列稀释,每个稀释度取0.1mL稀释液分别接种4种培养基,进行大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌、双歧杆菌的分离培养,培养基种类及培养方法见表2。采用平板菌落计数法统计细菌数量,菌群数量以每克肠内容物所含细菌群落总数的对数(lgCFU/g)表示。1.5.3免疫功能1.5.3.1.细胞因子分别按鸡IL-10ELISA检测试剂盒、鸡IFN-γELISA检测试剂盒说明书的操作步骤测定血清中IL-10和IFN-γ含量。1.5.3.2.新型农村流行病的抗药性价格1.5.3.3.免疫器官指数1.6数据处理及分析试验数据采用SPSS13.0软件中One-WayANOVA程序进行单因素方差分析,用Duncan氏法进行多重比较,结果用平均值±标准差表示。2结果与分析2.1828283232323232日进程由表3可知,7~14日龄,与Ⅰ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组平均日增重显著降低(P<0.05),料重比显著升高(P<0.05),且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异均不显著(P>0.05),各组平均日采食量差异均不显著(P>0.05)。14~28和28~42日龄时,Ⅱ组平均日增重显著低于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05),料重比显著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05),且Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组间差异均不显著(P>0.05),各组平均日采食量差异均不显著(P>0.05)。从全期来看,在平均日增重方面,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异均显著(P<0.05),其中Ⅳ组最高;在平均日采食量方面,各组差异均不显著(P>0.05);在料重比方面,Ⅱ组料重比最高,显著高于其他各组(P<0.05),Ⅳ组料重比最低,显著低于其他各组(P<0.05),且Ⅱ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05),Ⅰ、Ⅲ组间差异不显著(P>0.05)。2.2各组双歧杆菌数量由表4可知,14日龄时,与Ⅰ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌数量均显著降低(P<0.05),沙门氏菌数量虽有降低趋势,但差异不显著(P>0.05)。28日龄时,与Ⅰ组相比,Ⅱ组乳酸杆菌数量显著降低(P<0.05),Ⅱ、Ⅲ组双歧杆菌数量显著降低(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ组大肠杆菌、沙门氏菌数量均显著降低(P<0.05),其他组间差异均不显著(P>0.05)。42日龄时,与Ⅰ组相比,Ⅱ组乳酸杆菌数量显著降低(P<0.05),Ⅳ组乳酸杆菌数量显著升高(P<0.05),且Ⅱ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05);与Ⅰ组相比,Ⅱ组双歧杆菌数量显著降低(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ组双歧杆菌数量显著升高(P<0.05),且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异均显著(P<0.05);与Ⅰ组相比,Ⅱ组大肠杆菌数量显著升高(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ组大肠杆菌数量显著降低(P<0.05),且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异均显著(P<0.05);与Ⅰ、Ⅱ组相比,Ⅲ、Ⅳ组沙门氏菌数量显著降低(P<0.05),且Ⅲ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05)。2.3黄鼠狼免疫抑制功能的影响2.3.1、组间血清中il-10含量显著相关资料由表5可知,在氟苯尼考停药后第1天(14日龄),与Ⅰ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血清中IL-10、IFN-γ含量均显著升高(P<0.05),且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异均不显著(P>0.05)。在黄芪多糖使用后的第14和28天(28和42日龄),Ⅱ组血清中IL-10含量显著高于其他各组(P<0.05),Ⅳ组血清中IL-10含量显著低于其他各组(P<0.05),且Ⅱ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05),Ⅰ、Ⅲ组间差异不显著(P>0.05);Ⅱ组血清中IFN-γ含量在28日龄时显著高于其他各组(P<0.05),而Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组间差异均不显著(P>0.05);Ⅱ组血清中IFN-γ含量在42日龄时显著高于Ⅳ组(P<0.05),其他组间差异均不显著(P>0.05)。2.3.2组与其他各组新城疫抗体效价比较由表6可知,在氟苯尼考停药后及鸡新城疫活疫苗免疫前(14日龄),各组间新城疫抗体效价差异均不显著(P>0.05)。至鸡新城疫活疫苗一免后的第14天(28日龄),Ⅱ组血清中新城疫抗体效价显著低于其他各组(P<0.05),且Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组间差异均不显著(P>0.05)。至鸡新城疫活疫苗二免后的第14天(42日龄),Ⅱ组血清中新城疫抗体效价显著低于其他各组(P<0.05),Ⅳ组血清中新城疫抗体效价显著高于其他各组(P<0.05),且Ⅱ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05),Ⅰ、Ⅲ组间差异不显著(P>0.05)。2.3.3、、组法氏囊指数及尾素含量由表7可知,在氟苯尼考停药后第1天(14日龄),与Ⅰ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数均显著降低(P<0.05),且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异均不显著(P>0.05)。在黄芪多糖使用后第14天(28日龄),Ⅱ组胸腺指数、脾脏指数均显著低于其他各组(P<0.05),Ⅳ组胸腺指数、脾脏指数均显著高于其他各组(P<0.05),且Ⅱ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05),Ⅰ、Ⅲ组间差异不显著(P>0.05);Ⅱ组法氏囊指数显著低于Ⅰ、Ⅳ组(P<0.05),其他组间差异均不显著(P>0.05)。在黄芪多糖使用后第28天(42日龄),Ⅱ组胸腺指数显著低于其他各组(P<0.05),Ⅳ组胸腺指数显著高于其他各组(P<0.05),且Ⅱ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05),Ⅰ、Ⅲ组间差异不显著(P>0.05);Ⅱ组脾脏指数显著低于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05),其他组间差异均不显著(P>0.05);Ⅱ组法氏囊指数显著低于其他各组(P<0.05),其他组间差异均不显著(P>0.05)。3讨论3.1不同氟苯尼考的临床使用对鸡的生长性能影响日粮中添加黄芪多糖对肉鸡生长性能的影响与黄芪多糖的添加剂量、试验动物机体情况等密切相关。司昌德等(2008)认为,日粮中添加0.1%或0.3%黄芪多糖对肉仔鸡生长性能无显著影响;魏炳栋等(2012)研究表明,日粮中分别添加0.4%和0.8%黄芪多糖能有效缓解氢化可的松对肉鸡产生的氧化应激反应,并消除其副作用,提高肉鸡生长性能;孙波等(2013)研究发现,日粮中添加500mg/kg黄芪多糖能显著提高肉鸡的生长性能。本试验结果表明,肉鸡饮水中添加200mg/L氟苯尼考后能降低肉鸡平均日增重及平均日采食量,增加料重比,使健康肉鸡处于免疫抑制状态,而日粮中添加500和1000mg/kg黄芪多糖均能显著提高免疫抑制肉鸡的平均日增重,显著降低料重比,消除氟苯尼考对肉鸡的免疫抑制作用,提高其生长性能,且以添加1000mg/kg黄芪多糖效果较好。由此可知,日粮中添加黄芪多糖可有效消除氟苯尼考诱导肉鸡的免疫抑制作用,提高畜禽的生长性能,这一发现将为氟苯尼考的临床应用及黄芪多糖在畜禽养殖中的产业化开发和应用提供重要理论依据和实践参考。3.2不同剂量氟苯尼考对鸡肠道微生物菌群的影响肠道正常菌群结构是维持机体健康的重要环节和保障,大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌、双歧杆菌均是畜禽消化道内的正常菌群,当大肠杆菌、沙门氏菌的含量过高将导致幼畜下痢并发生炎症,而乳酸杆菌、双歧杆菌具有较强的耐酸性,对致病菌有较强的颉颃作用,是动物机体抵抗疾病的一道天然屏障(孙笑非等,2014)。当动物处于应激、饲料突变、致病菌(毒、虫)感染等带来的免疫抑制状态时,常常会导致肠道菌群异常,而菌群失调将严重影响机体对营养物质的吸收,降低机体免疫力,削弱肠道的屏障功能,进一步加重疾病。由于黄芪多糖具有天然性、多功能性、无毒副作用、无抗药性和无残留等优点,因此能有效调节畜禽胃肠道的微生物菌群结构,抑制有害菌的生长,促进有益菌的增殖。高杨等(2011)研究发现,日粮中添加黄芪多糖能显著调节肉鸡肠道的微生态平衡,降低有害菌(大肠杆菌)的数量,增加有益菌(乳酸杆菌、双歧杆菌)的数量。许钦坤等(2013)研究表明,黄芪多糖对大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌3种致病菌均有明显的抑制作用。本试验首次研究在肉鸡处于免疫抑制状态下,日粮中添加黄芪多糖对其肠道微生物菌群(乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌)的影响,结果表明,肉鸡饮水中添加200mg/L氟苯尼考能降低肉鸡肠道乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的数量,这可能是由于氟苯尼考的抑菌作用所导致。在氟苯尼考停药后,未饲喂黄芪多糖组肠道乳酸杆菌、双歧杆菌数量恢复非常缓慢,但黄芪多糖添加组肠道中乳酸杆菌、双歧杆菌数量迅速增加,至42日龄已显著高于对照组;此外,未饲喂黄芪多糖组肠道中大肠杆菌、沙门氏菌数量在氟苯尼考停药后逐渐增加,但黄芪多糖添加组肠道中大肠杆菌、沙门氏菌数量没有增加,且逐渐降低。因此,日粮中添加500和1000mg/kg黄芪多糖均能消除氟苯尼考诱导的免疫抑制作用,显著促进肉鸡盲肠中有益菌(双歧杆菌和乳酸杆菌)的增殖,抑制有害菌(大肠杆菌和沙门氏菌)的生长,调节免疫抑制肉鸡肠道微生态平衡。3.3新城疫抗体效价对免疫作用的影响动物机体免疫功能的检测方法很多,但通过检测血清中细胞因子的变化来了解动物机体免疫状态的研究却较少,因IL-10能阻止B细胞的凋亡,提高细胞增殖、分化和MHC-Ⅱ的表达,在机体处于免疫抑制状态时,IL-10的表达量会升高,是主要的体液免疫检测指标(马振乾等,2011)。而IFN-γ参与抗原呈递和特异性免疫的识别过程,在机体处于免疫抑制状态时,IFN-γ的表达量升高,是主要的细胞免疫检测指标(马振乾等,2011)。本试验结果发现,日粮中添加黄芪多糖可降低免疫抑制肉鸡血清中IL-10、IFN-γ含量,且随肉鸡日龄的增加效果越明显,表明黄芪多糖可调节免疫抑制肉鸡的免疫功能,提高机体的体液免疫和细胞免疫,其具体作用机制还需进一步研究。检测新城疫抗体效价是衡量新城疫疫苗免疫效果最简单、最有效的方法。本试验结果表明,日粮中添加黄芪多糖可显著提高免疫抑制肉鸡血清中新城疫抗体效价,且随添加剂量的增加免疫效果越好。胸腺、脾脏、法氏囊是禽类重要的免疫器官,是禽类动物发挥免疫功能的重要器官,其指数是衡量禽类免疫功能的主要指标之一(刘晖等,2013)。氟苯尼考作为预防药物具有一定的免疫抑制作用,李汝春(2008)研究表明,高剂量氟苯尼考在短期内可对鸡的胸腺、法氏囊、盲肠扁桃体等免疫器官造成不可逆的轻度损害,本试验结果亦表明饮水中添加200mg/L氟苯尼考能降低肉鸡胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数,对肉鸡胸腺、脾脏、法氏囊免疫器官造成了较大损害,且至停药后28d仍没有完全恢复。而黄芪多糖能促进免疫器官的发育,增强机体免疫力,提高机体抗病力。Li等(2009)研究表明,日粮中添加220mg/kg黄芪多糖能显著提高仔鸡的免疫器官指数,改善仔鸡的免疫功能。本试验结果发现,在免疫抑制肉鸡日粮中添加500和1000mg/kg黄芪多糖均能显著降低由氟