营养不良型大疱表皮松解症新生儿col7a1基因异常分析

营养不良型大疱表皮松解症新生儿col7a1基因异常分析

不良的共济失，表皮松弛（deb）是一组以皮肤或粘膜损伤为主的共济失。如果发生轻度事故，可能会发生水泡或大疱疹，愈合后会留下萎缩的痕迹。DEB包括常染色体显性遗传和隐性遗传两类,均与编码基底膜下Ⅶ型胶原的COL7A1基因的突变有关。COL7A1基因定位于人3p21.3区域,有118个外显子,是迄今发现的外显子最多的基因,长度23kb。目前大多数实验室对于DEB的基因诊断采取传统的Sanger测序法进行COL7A1全基因外显子区的序列分析,该方法耗资大,而且费时、费力。近年来第二代测序技术发展迅速,因其具有高通量、高性价比的特点,在临床遗传病基因诊断的应用日益广泛,但目前该技术尚未应用于DEB的基因诊断。本研究应用目标区序列捕获和二代测序技术,对1例新生儿营养不良型大疱表皮松解症进行检测,并应用Sanger测序对于突变位点在患儿及其家系中进行验证和检测,为DEB的诊断提供了新的思路。1cola7a1基因回复突变位点的确定患儿,男,生后5h,因“发现皮肤缺损5h”入院。患儿系G1P1,因“孕母产前发热”行剖宫产娩出。患儿母亲在8岁时曾出现皮肤大疱样皮疹,其母亲和姐妹也有类似的皮肤病变。患儿父亲无相关疾病史。其父母非近亲结婚。查体:患儿双侧外耳廓可见烫伤样改变,耳廓结构完整,基地潮红,轻度糜烂,轻触有出血,唇部、臀部、双肘关节、双手指末端、双小腿见片状表皮缺失,糜烂面及松弛型大疱,疱液浑浊,疱壁松弛,尼氏征阴性。口腔内可见少量表皮破损,伴少量黏液样物质流出(图1)。征得研究对象或其监护人知情同意后,提取了患儿及其父母、外祖母外周血,应用北京Tiangen公司的TIANampBlood血液基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP318)提取全血基因组DNA。采用第二代高通量测序方法,取3μgDNA经美国Covaris公司CovarisS2超声仪将其随机打断,纯化后的DNA使用末端修复反应缓冲液和末端修复酶混合物进行末端补平,进而在其3′端加入A形成特有的悬垂结构,通过接头连接形成标准的Solexa测序文库,取1μl制备好的文库样本,用Nanodrop2000对文库样本进行定量。文库经PCR扩增后,取3μgDNA,应用北京迈基诺基因科技研发的新生儿遗传疾病基因检测试剂盒进行杂交,洗脱的杂交文库质控合格后经IlluminaHiSeq2000上机测序。按照本实验室常规的Sanger法对c.6781C>T点突变患儿样本进行测序验证。并对其父母、外祖母的样本进行该位点的序列分析。扩增引物如下,COL7A1-F:5′-GACATCCGACTTGTTCTCCG;COL7A1-R:5′-GGCCAGGTTCTCCTTTAGGT。高通量测序数据应用SOAPaligner和SOAPsnp软件,过滤低质量值(质量值≤20)和低覆盖度(深度≤10)的SNP,找出序列中的SNP;用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息;利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对SNP和InDel进行注释,确定突变位点。第二代高通量测序结果显示患儿在chr-48610345的位置COL7A1基因(NM_000094)第86个外显子上发现1个杂合突变点:c.6781C>T,引起该基因第2261位氨基酸由精氨酸变为终止密码子(p.R2261X)(图2)。针对c.6781C>T点突变Sanger测序结果与二代高通量测序结果一致(图3)。为了确定患儿COL7A1基因c.6781C>T突变位点的遗传来源,对患儿的父亲、母亲、外祖母的该位点进行序列分析。结果显示患儿父亲正常,其母亲和外祖母与患儿相同,在COL7A1基因外显子86上第6781碱基发生杂和突变。见图4。2deb基因检测本例患儿出生时在口腔内、双侧外耳廓、双下肢及右肘部就出现皮肤缺损、糜烂,提示患儿在宫内就已经发生皮肤病变,而且水疱分布在皮肤易摩擦和受压处的耳廓和四肢,具有典型大疱表皮松解症的临床表现。应用二代高通量测序结果显示,患儿存在COL7A1基因外显子86上第6781位碱基C→T的杂和突变,引起第2261位氨基酸由精氨酸变为终止密码子(p.R2261X),导致提前终止密码子(prematureterminationcodon,PTC)的产生。该突变已有报道,该报道为1例新生儿起病的Hallopeay-Siemens型常染色体隐性大疱表皮松解症,是常染色体隐性遗传大疱表皮松解症中最严重的一个亚型,患儿躯干及四肢皮肤缺损、糜烂,口腔黏膜、眼结膜和鼻子突出部分均有破损,手脚指甲生后3个月全部溃烂脱落,基因检测结果显示该患儿为携带434insGCAT和R2261X两种复合杂合突变,两种突变分别来源于父亲和母亲,患儿携带的两种突变,434insGCAT导致移码突变,从而使外显子5产生PCT,而R2261X导致外显子86产生PCT,使Ⅶ型胶原肽链合成提前终止,最终致蛋白质缩短,不能产生正常的Ⅶ型胶原,因而临床症状较本文报道的患儿严重。本例患儿仅为1条染色体发生突变,所以临床症状轻。为了明确家系中其他成员是否存在相同突变,通过一代测序表明家系中患儿的母亲、外祖母均存在R2261X的突变,而患者父亲和100例正常对照均不存在此突变,排除该突变是基因多态性的可能,并结合已有的文献报道,提示此突变是导致该家系病变的特异性突变,患儿的突变基因来源于母亲的家系,但由于表型异质性,患儿与其母亲、外祖母的临床表现差异较大。已有文献报道,DEB的基因型和表型之间具有密切关联,但表型异质性较为多见,产生的原因可能为Ⅶ型胶原分子上不同功能位点发生突变,引起“蛋白自杀”,或者是由于等位基因上不同突变组成的复合突变所产生的不同结果,还有可能是由于某些突变需要COL7A1基因2个等位基因的纯合子共同表达。由此可见利用基因检测明确DEB分型非常重要,但目前大多数实验室对于DEB的基因诊断采取传统的Sanger测序法进行COL7A1全基因外显子区的序列分析。国内报道一个DEB家系的基因突变检测,设计了72对引物对COL7A1基因全部118个外显子进行序列分析,检测费用较高,这些费用包括72个PCR反应及产物纯化等样品处理的费用、毛细管电泳、实验耗材以及设备维护费用等,以及大量的序列片段分离并观察分析结果非常耗时、耗力。相对于Sanger测序,第