益生芽孢杆菌体外抑菌活性及耐药性研究

益生芽孢杆菌体外抑菌活性及耐药性研究

芽杆菌是一种抗逆性厌氧菌或球形细菌，属于芽杆菌科。它们对高温、高热、紫外光、电磁辐射和某些化学药品均有很强抗逆性,且生长快,广泛存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素,已成为研究热点,并作为益生菌被广泛应用到饲料、食品、化学等领域。抗生素作为饲料添加剂,因残留和畜产品安全问题,使用已受到严格限制。益生菌的重要性质是对病原菌的抑菌活力,且无毒副作用、无残留,因此可部分代替抗生素,且是抗生素的良好补充,但从抗生素和益生菌的作用机理及应用技术上看,益生菌在很长一段时间内很难完全取代抗生素。当抗生素的使用范围限制到一定程度时,必将有1个与益生菌剂配合使用的时期,因此了解各类益生菌对各种常用饲用抗生素的敏感性至关重要。本研究用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌2种益生菌对常见肠道致病菌抑菌活性以及对饲料中几种常用抗生素敏感性进行测定,以期为生产实践提供理论依据。1材料和方法1.1动物培养1(1)菌种。益生菌:枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌粉由武汉雄峰科技有限公司提供。致病菌:大肠埃希菌C83917、大肠埃希菌C83901和鼠伤寒沙门菌,均从中国兽医药品监察所菌种室购得。(2)抗生素。金霉素(15%)、抗敌素(15%)、吉他霉素(50%)、黄霉素(40%)购于武汉金鼎生物有限公司。硫酸黏菌素(90%)、喹乙醇(90%)、硫酸新霉素(15%)、杆菌肽锌(15%),购于湖南省畜牧兽医研究所动物药厂。(3)培养基与器材。培养基:营养肉汤培养基,在高压灭菌锅中,用0.1MPa灭菌20min;固体培养基中加入2.0%琼脂。器材:牛津杯、培养皿、微量稀释板、恒温培养箱、净化工作台、立式压力蒸汽灭菌器、电子精密天平、微量可调移液器、游标卡尺。1.2方法1.2.1致病菌的检测(1)菌液准备。将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌粉经活化、稀释、涂平板培养后挑典型菌落分别接种于肉汤培养基中,于37℃恒温箱培养24h后制成益生菌菌液备用。将3种致病菌原菌种接种于肉汤培养基中,37℃恒温箱培养24h后,用无菌生理盐水稀释成致病菌菌液备用,浓度约为105CFU/mL。(2)致病菌液涂布。用微量移液枪取10-3稀释浓度致病菌液0.1mL置于制备好的营养琼脂检测平板内,用无菌玻耙将指示菌液在平板上涂布均匀,37℃恒温干燥20min以固定菌液,使菌液渗入培养基表层内,取出后即可进行抑菌试验。(3)加入益生菌菌液。用镊子夹取无菌牛津杯轻轻放入检测平板培养皿中,在水平放置的平皿中均匀放置4只牛津杯。吸取益生菌菌液0.2mL至牛津杯中(注意不要将益生菌菌液溢出杯外)。每种致病菌分别做2个重复样,1个对照样,对照样只加肉汤。然后将加好益生菌菌液的培养皿正面放置37℃恒温培养箱中培养24h,观察2种益生菌分别对3种致病菌的抑菌情况。1.2.2菌药物贮藏液的制备及接种(1)抗菌药物储备液配制。用分析天平精确称取抗菌药物粉剂,配制成含量为12800μg/mL的抗菌药物贮存液。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境,保存期不超过6个月。(2)稀释抗菌药物制备及菌液接种。采用微量肉汤稀释法连续倍比稀释,再每管加菌液0.1mL,第1至第11孔药物浓度最终分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。其中,第12管为不含药物的生长对照。将接种好的微量板密封,37℃恒温培育16~20h。观察结果。2结果与分析2.1抑菌圈测定结果抑菌效果判断。抑菌圈直径≤8.00mm视为不敏感,8.02~13.00mm为低度敏感,13.02~19.00mm为中度敏感,≥19.02mm为高度敏感。用游标卡尺量取抑菌圈大小,观察抑菌效果,结果见表1。由表1可见,测量得抑菌圈直径在10~15mm之间,为低、中度敏感,对照试验对3种致病菌抑菌圈直径为0,说明肉汤没被污染。由此可知,2种益生芽孢杆菌对鼠沙门菌抑菌作用比对大肠埃希菌的作用强,而枯草芽孢杆菌对鼠沙门氏菌的抑菌作用又比地衣杆菌稍强,枯草芽孢杆菌对这3种菌抑菌结果与鲁晓红等报道的基本一致。2.2药物浓度对枯草杆菌菌种和益生菌的影响取肉眼观察无细菌生长的孔中液体涂营养琼脂培养后,观察菌落数,只有硫酸新霉素在药物浓度为32μg/mL时,枯草芽胞杆菌菌落数小于5,则说明硫酸新霉素这一药物浓度为枯草杆菌的最低杀菌浓度(MAC)。其他7种药物只对枯草杆菌在实验浓度范围内有抑菌作用,而无杀菌作用。以上8种药物对地衣芽孢杆菌在试验浓度范围有抑菌作用,无杀菌作用。由表2、3可以得出,抗敌素、硫酸黏菌素、喹乙醇药物浓度达128μg/mL时不会影响2种益生菌活率,吉他霉素和硫酸新霉素在0.25~2μg/mL时对这两种益生菌开始产生抑制作用。用微量肉汤稀释法得出的结果与之前采用这些药物制作的药敏纸片测这2种益生菌敏感性所得结果基本相近。3芽孢杆菌的活性(1)枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素。很多研究表明,地衣芽孢杆菌产生的胞外产物具有重要生物活性,含有肽类或非肽类抗菌物、小分子活性物质及丰富的胞外酶系。已分离获得有短杆菌肽和头孢菌素C等抗菌物质,仅枯草芽孢杆菌就能产生68种抗生素,正是这些胞外产物对3种致病菌产生了抑制作用。(2)枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均能形成芽孢,以芽孢形式添加到饲料中,在不宜环境中,不会活化为营养细胞,故饲料中抗生素的量对芽孢杆菌活率影响不大,只有当动物肠道内抗生素浓度达到其μIC时,才会影响其活率。(3)据报道,细菌素是1种只对同类菌才产生抑制作用的物质。硫酸新霉素是从链丝菌属细菌培养液中提取的多组分混合物,链丝菌属细菌是一类革兰阳性亦能生成孢子的细菌,生理特性与这2种益生芽孢杆菌基本相似,故硫酸新霉素对这2种益生菌抑菌作用较强。枯草芽孢杆菌分泌的抗菌物质之一,是一类具有14~16元内酯环结构的物质,而吉他霉素属大环内酯类抗生素,通过抑制细菌蛋白质合成产生抗菌作用,主要对革兰阳性菌有效,故对枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌也有较强抑菌作用。(4)本试验研究的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对大肠埃希菌C83917、大