侧脑室注射链脲佐菌素对大鼠脑psd-95和shank1表达的影响_第1页
侧脑室注射链脲佐菌素对大鼠脑psd-95和shank1表达的影响_第2页
侧脑室注射链脲佐菌素对大鼠脑psd-95和shank1表达的影响_第3页
侧脑室注射链脲佐菌素对大鼠脑psd-95和shank1表达的影响_第4页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

侧脑室注射链脲佐菌素对大鼠脑psd-95和shank1表达的影响

中风和阿尔茨海默病(ad)是老年人常见的神经退行性疾病。散发性AD的受累脑区,神经细胞胰岛素信号传导系统功能障碍,导致能量代谢紊乱是其明显特征。链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)是亚硝基脲衍生物,脑室内小剂量注射STZ可拮抗脑内胰岛素受体的酪氨酸酶活性,导致胰岛素信号传导障碍,引起大鼠脑持久的葡萄糖代谢紊乱和能量生成受阻,海马乙酰胆碱转移酶活性降低和氧化应激反应以及学习和记忆下降。此模型可以模拟AD脑的进行性能量代谢紊乱和认知功能障碍。阿尔茨海默病患者的记忆障碍是早期突出表现,其程度与突触数目的丢失及突触功能的丧失密切相关。脑内Aβ蛋白的聚集可破坏突触的完整性和可塑性,使突触功能丧失。已证实脑室注射STZ可引起脑内Aβ表达增加。富含脯氨酸的突触相关蛋白——突触后致密区蛋白-95(postsynapticdensity95,PSD-95)和Shank1蛋白是突触后致密区内核心的构架蛋白,在维持突触正常功能和可塑性方面有重要作用。本研究从大鼠海马突触相关蛋白PSD-95和Shank1蛋白表达的变化来探讨脑室注射STZ对突触功能的影响。材料和方法1.实验动物及设备雄性Wistar大鼠30只,320~350g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2002-0003,饲养于首都医科大学宣武医院实验动物室SPF级鼠房。根据SPSS统计软件产生的随机数字将大鼠随机分为STZ造模组和对照组,每组各15只。自由进食、饮水,昼夜节律光照。2.人工瞳神经口式脑立体定位造模组大鼠禁食不禁水12h,分别于第1d、3d侧脑室注射STZ,按3mg/kg用量,以25g/L溶于人工脑脊液(CSF)中,每只大鼠20μl(0.5mg)/每侧脑室。对照组大鼠在相同条件下脑室注射同等体积的人工脑脊液。手术方法:大鼠称重,以10%水合氯醛腹腔麻醉(300mg/kg);头部皮肤备皮、消毒,沿中线作1cm左右长的矢状切口,暴露颅骨,将大鼠固定于立体定位仪上,参照大鼠脑立体定位图谱及文献,在前囟后0.8mm、中线水平旁开1.5mm处,左右各定位一点;在定位点处钻直径约0.8mm的小孔,用微量加样器在左右脑室各缓慢注射20μl药液,垂直进针,深度为3.6mm;注药后留针5min左右,缓慢拔针,皮肤缝合消毒。术后常规饲养21d。3.血液中的糖含量分别于术前和术后(21d)尾静脉采血,微量血糖仪(强生公司)测定外周血糖。4.大鼠脑的固定术后21d,每组取10只大鼠,动物麻醉(方法及剂量同前),打开胸、腹腔,充分暴露心脏和肝脏。剪开左侧心尖部,插导管于左心室并固定,同时剪开右心耳。快速灌注生理盐水250ml左右,至肝脏完全变白,右心耳流出澄清液体后,换用4%多聚甲醛固定液先快速再缓慢灌注100ml左右,至大鼠肝脏变硬,肢体僵直,即固定完成。断头,完整取出鼠脑后投入含30%蔗糖的多聚甲醛溶液中固定至脑下沉。-20℃恒冷箱冠状连续切片,片厚35μm。5.免疫总体生物素-pap的制备免疫组织化学漂浮染色法,切片以0.01mol/LPBS洗5min×3次,用3%H2O2室温孵育30min;PBS洗5min×3次,8%~10%羊血清封闭孵育30min,吸出血清,分别加入稀释好的一抗(宣武医院多肽室提供,兔来源):PSD-95(1∶1000)和Shank1(1∶1500),4℃孵育过夜;PBS洗5min×3次。加生物素标记的抗兔二抗(北京中山试剂公司,1∶300稀释),室温孵育1h;PBS洗5min×3次,加HRP标记的PAP复合物(北京中山试剂公司,1∶300稀释),室温孵育1h;PBS洗5min×3次,DAB显色,自来水终止反应,裱片,切片经脱水、透明、封片后光镜下观察。阴性对照:用正常血清代替一抗,在相同条件下进行免疫组织化学染色,结果为阴性。6.免疫印迹分析每组取5只大鼠,麻醉后冰上快速断头剥离海马,加入组织裂解液[50mmol/LTris-HCl缓冲液pH7.4,10g/L苯甲基磺酰氟(phenylmenthylsulfonylfluoride,PMSF),0.5mol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)]匀浆,12000r/min4℃离心30min,用Lowry法蛋白质定量。按《分子克隆技术》方法进行免疫沉淀和免疫印迹分析,AP法显色。标准分子量蛋白质为Invitrogen公司产品;PSD-95(1∶2000)、Shank1(1∶2000)抗体均由宣武医院多肽室提供。每组重复3次。7.统计处理采用SPSS10.0统计软件,数据以均值±标准差表示,显著性检验采用独立样本t检验,以P<0.05为有统计学意义。结果1.两组大鼠血糖情况术前对照组大鼠血糖4.99±0.57;模型组大鼠血糖5.19±0.55;术后21d对照组大鼠血糖4.78±0.80,模型组大鼠血糖4.86±0.53。手术前后,模型组与对照组大鼠血糖值比较,P>0.05。2.nk1阳性反应神经元/神经元计数比较模型组海马CA1区PSD-95和Shank1阳性反应神经元较对照组明显减少,分布稀疏,染色较淡,神经元计数差异有显著性意义(P<0.01)(附表;图1,2)。3.经过测试的结果显示模型组PSD-95和Shank1表达条带均比对照组明显变细,颜色变浅,表明蛋白表达减少(图3)。突后致密区及shank蛋白家族AD的特征之一是受累脑区的葡萄糖代谢率和细胞产生能量明显下降。STZ是亚硝基脲衍生物,有β细胞毒性,在外周可以选择性破坏胰岛细胞,引起葡萄糖代谢紊乱,导致糖尿病;在中枢可引起胰岛素受体自身磷酸化和内在酪氨酸激酶活性降低,影响胰岛素/胰岛素受体信号系统传导,并引起能量代谢紊乱。侧脑室注射STZ抑制胰岛素/胰岛素受体信号系统传导,引起糖代谢的几个关键酶的活性降低,从而导致严重的氧化代谢障碍,三磷酸腺苷减少以及氧化应激反应,乙酰胆碱转移酶活性下降,神经髓鞘毒性及认知功能障碍等。这种动物脑内糖代谢异常,学习记忆能力明显下降,可被作为散发型AD的模型应用。我们予大鼠双侧侧脑室注射STZ3mg/kg后,术前术后监测外周血糖无变化。记忆障碍是AD早期的突出表现,它出现在AD的特征性标志老年斑形成之前,与突触数目的减少有关。在AD早期,突触的功能与结构受损主要由Aβ蛋白所致。Aβ蛋白的产生与聚集是AD发病的中心环节,可形成老年斑。AD患者脑组织中Aβ蛋白主要以Aβ40和Aβ42两种形式存在。近来研究已证明,脑室注射STZ可引起脑内Aβ40和Aβ42表达增加。Aβ40和Aβ42分别由高尔基网状系统和内质网网状系统产生。胰岛素受体信号传导系统功能紊乱导致脑葡萄糖代谢异常和能量生成减少,可引起高尔基体和内质网功能障碍,Aβ沉积。这种变化可能导致突触的损伤。突触传递与动物的学习记忆能力密切相关,AD的一个重要病理改变是出现神经元突触丢失和破坏。突触后致密区是接受和整合突触信号,并将其传导给突触后细胞的分子装置,在突触可塑性中起重要作用。突触后致密区的PSD95、Shank1两种蛋白对突触信号转导有重要作用。突触后致密区(postsynapticdensity,PSD)是位于突触后膜胞浆面的半圆形区域,是突触后信号转导和整合的结构基础。PSD95是在谷氨酸能突触的突触后致密区中发现的一种特殊蛋白质,含有N末端的3个PDZ结构域、1个SH3结构域,C末端的1个GK结构域。PSD-95通过不同结构域与其他蛋白相互作用,不仅能够聚集NMDA受体及其信号通路中的相关蛋白分子,组成受体-信号分子-调节分子-靶分子复合物,还可通过突触后致密区多种蛋白分子的相互作用,参与突触连接的形成和维持,在介导和整合NMDA受体信号转导中具有关键性作用。敲除PSD-95基因可引起小鼠长时程增强(LTP)的改变和学习记忆功能障碍。Shank蛋白家族是一种在突触信号转导中起重要作用的骨架蛋白,它主要有3个成员:Shank1、Shank2、Shank3。其中Shank1仅表达于脑组织。Shank蛋白自N端至C段共由5个结构域组成,分别是:由5~6个重复的锚连蛋白(ankyrin)组成的Ank结构域,1个SH3(Srchomology3)结构域,1个PDZ(PSD95/Dig/ZO-1)结构域,1个长度超过蛋白全长1/2的富含脯氨酸的结构域和1个SAM(sterilealphamotif)结构域。所有结构域都包含有与特定蛋白质结合的位点,这种多结构域的特点使之能很好地行使骨架蛋白的功能。其PDZ可与PSD-95的GK结构域结合继而结合到突触后膜上的NMDA受体;SH3可与GRIP结合继而结合到突触后膜上的AMPA受体;而富含脯氨酸的区域可通过Homer蛋白家族与突触后膜上的代谢型谷氨酸受体mGluR结合。因此,Shank1将突触后膜上的3种谷氨酸受体串联起来,结合在NMDA信号复合体中,

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论