流行性感冒病毒的研究进展

流行性感冒病毒的研究进展

1病毒属asoavirus流行感冒，简称流行性感冒，是由粘膜病毒科的流行性感冒病毒引起的一种急性呼吸道感染。流感每年在温带的秋冬季节大量流行,与病毒有关的严重并发症导致了在危重患者中有较高的死亡率。仅在美国,流感每年就有2500万-5000万人患流感,30万人住院治疗,约有2万-4万人死亡。据GlaxoWellcome公司统计,每年用于治疗流感的费用约为1.2亿美元。黏液病毒科下分5个属,包括甲型(A)流感病毒属、乙型(B)流感病毒属、丙型(C)流感病毒属,传染性鲑鱼贫血病毒属(Isavirus)和托高土病毒属(Thogotovirus)。前4个属之下,每个属只有1个种,分别为甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、传染性鲑鱼贫血病毒(Infectioussalmonanemia),后1个属分为托高土病毒(Thogotovirus)和Dhorivirus等2个种。甲型流感病毒以病毒表面突起的两种蛋白质(血凝素,Hemagglutinin及神经氨酸酶,Neuraminidase)来区分。甲型病毒共有16种不同的血凝素以及9种不同的神经氨酸酶,命名上便以H1N1,H2N2依此类推来命名。目前仅确定H1N1、H2N2、H3N2这3种会感染人类。另外H5N1禽流感虽然暂时未有人类之间互相传染的证据,但世界各地卫生部门正密切关注其引起世界大流行的可能性。甲型病毒最常见也易引起世界大流行(pandemics)及地区流行(epidemics)。2009年4月底,在墨西哥发现了首例甲型H1N1流感患者,起初被命名为“猪流感”。《科学》杂志2009年5月22日报道甲型H1N1流感病毒的最主要基因早在10年前就被发现并定义,这种病毒很可能已在一些国家的猪身上传播了10多年而未被发现。《新英格兰医学杂志》2009年5月27日报道,甲型H1N1流感病毒这种新病毒株为8个流感基因片段(PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,NS)的重组,既往未见报道,甲型H1N1流感病毒与美洲、欧洲和亚洲分离的重组猪流感病毒有密切的关系[2、3]。2预防新流感病毒的药物临床应用的抗流感药有金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦及奥司他韦4种。金刚烷胺(Amantadine)是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药,该药能有效地预防不同株的甲型流感病毒所引起的感染。金刚烷胺用于预防与流感患者密切接触的人,特别适用于在医院及团体单位使用;也可用于预防或治疗亚洲甲-Ⅱ型流感病毒所引起的呼吸道感染。金刚乙胺(Rimantadine)属于三环胺类,对A型流感病毒有预防和治疗作用,且作用强于金刚烷胺。扎那米韦(Zanamivir),也叫瑞乐沙,用于流感的预防和治疗,适用于成年患者和12岁以上的青少年患者,治疗由A型和B型流感病毒引起的流感。扎那米韦经口吸入给药。罗氏制药有限公司是奥司他韦(Oseltamivir)的专利持有人,目前他们生产的奥司他韦磷酸盐胶囊剂(商品名Tamiflu,中国大陆称达菲,中国香港译特敏福,中国台湾译为克流感)是市场上唯一的奥司他韦制剂。根据罗氏公司网站公布的信息,在起病后24小时内服用奥司他韦的患者,病程会减短30%-40%,病情会减轻25%,作为预防用药,奥司他韦对流感病毒暴露者的保护率在80%-90%之间。2004年2月4日,中国卫生部印发了《人禽流感诊疗方案(试行)》,推荐达菲为对禽流感病毒H5N1和H9N2有抑制作用的药物。世界卫生组织于2004年2月透露并于8月再次宣布,奥斯他韦(达菲)是预防和治疗禽流感和发生人类流感流行时的首选用药。3奥司他韦耐药性研究人们对于奥司他韦和扎那米韦的依赖日渐增长,一是因为季节性A(H1N1)流感对于老牌的经典抗流感药物金刚烷类(金刚烷胺和金刚乙胺)已经产生高度的耐药性,二是因为金刚烷类药物对于流感B病毒的作用微小,三是因为金刚烷类药物对于治疗和预防甲型H1N1流感无效。奥司他韦是最为广泛应用并被各国储备的神经氨酸酶抑制剂(NAI)药物,现阶段,A(H1)季节性流感病毒对于奥司他韦的耐药性现象尤为突出,这种耐药性与病毒H274Y位的神经氨酸酶的氨基酸变化有关。2005年12月,牛津大学的研究结果显示禽流感病毒开始对达菲产生耐药性。2005年12月22日,罗氏药厂敦促增加达菲的剂量对抗禽流感。近年来,金刚烷胺耐药性A(H3N2)流感病毒和奥司他韦耐药性A(H1N1)流感病毒的数量在全球范围内呈上升趋势。(VicenteD等)但是在研究中,也有发现耐药性阴性结果的报道,比如BurrelS等称,其对法国西南部3年内的季节性A(H1N1)流感、季节性A(H3N2)流感和甲型H1N1流感病毒进行了奥司他韦耐药性的分析,未发现奥司他韦耐药现象。对于扎那米韦的体外试验发现,当药物浓度不断增加时,仍有流感病毒对扎那米韦的敏感性下降。经分析,这与病毒突变引起神经氨酸酶及血细胞凝集素二者或其一的氨基酸发生改变有关。2009年4月,全球暴发了甲型H1N1流感疫情。2009年《自然-生物技术》上的一篇文章指出,甲型H1N1流感病毒只需要单一突变就可以使抗病毒药物“达菲”对其失效,这意味着耐药的病毒很容易出现。2009年7月8日,WHO发布消息,已经在丹麦、日本、中国香港出现了感染了对达菲耐受的甲型H1N1流感病毒的患者。2009年7月22日,加拿大报告在甲型H1N1流感患者中出现首例对达菲耐药的病例。GullandA在2009年11月撰文称,在威尔士发现了首例奥司他韦耐药性甲型H1N1流感病毒在患者之间传播的事件。针对以上国家报告的病毒耐药事件,全球流感监测网络在世卫组织合作中心和其它实验室支持下进行了系统监测,确证了对奥司他韦具有耐药性的甲型H1N1流感病毒的零星事件的真实性。事实上,目前具有耐药性的大流行性流感病毒的病例数目较少,世界卫生组织多次表示,病毒并未发生实质性变异,能影响临床特征的变异只是偶尔才会出现,耐药性病毒也尚未形成人际间传播能力,因此疫苗和药物仍然有效。据世界卫生组织调查,截至2009年9月25日,全球共发现和鉴定了28个耐药性病毒。所有这些病毒都呈现出同样的H275Y变异,对奥司他韦产生了耐药性,但却并不对扎那米韦具有耐药性。所以,如果患者由于受到对奥司他韦具有耐药性病毒的感染而病情严重或症状恶化,仍可采用扎那米韦对其进行治疗。在这些耐药性病毒中,12个耐药性病毒是为了防止接触后感染使用奥司他韦所致;6个耐药性病毒与使用奥司他韦治疗免疫功能严重低下患者有关;4个耐药性病毒来自接受奥司他韦治疗的患者样本;有2两个病毒来自并未采用奥司他韦进行治疗或预防的患者。有关方面正在鉴定其余的病毒。世界卫生组织驻华代表处新闻官陈蔚云11月24日证实,全球已经有挪威、乌克兰、美国、墨西哥、巴西、日本和中国等7个国家报告了变异病毒,不过是极少数的。这7个国家的病毒变异都是同一种变异。此外,挪威等7国报告的甲型H1N1流感病毒变异毒株和英美等国报告的耐药性毒株体现在两个不同的蛋白质上,两者之间没有关系。4神经氨酸酶金刚烷胺及金刚乙胺上市较早,两者只抑制甲型流感病毒。金刚烷胺及金刚乙胺均为笼状化合物,金刚烷胺及金刚乙胺抗病毒作用机制与其对流感病毒M2蛋白离子通道的作用有关,二者作用机理相同,作用于病毒四聚体穿膜蛋白M2离子通道,阻碍H+离子由酸化的内体通过M2离子通道进入毒粒内部,不能使毒粒内部pH降低,从而不能诱导酸依赖的HA构型改变,因而阻碍了病毒外膜与内体膜(浆膜)融合,使病毒基因组复合体不能进入胞浆。两者作用于病毒吸附后到病毒外膜与内体膜融合这一时间段。流感病毒神经氨酸酶是病毒复制的关键酶,在病毒的生活周期中扮演了重要的角色,流感病毒在宿主细胞内复制表达和组装之后,会以出芽的形式突出宿主细胞,与宿主细胞以凝血酶-唾液酸相连接,神经氨酸酶以唾液酸为作用底物,可催化唾液酸水解,解除成熟病毒颗粒与宿主细胞之间的联系,使之可以自由移动侵袭其他健康的宿主细胞。神经氨酸酶可以破坏细胞表面病毒血凝素(HA)受体,协助子代毒粒由感染细胞表面释放,防止毒粒聚集,促使毒粒通过呼吸道黏液,有利于其在呼吸道黏膜扩散。抑制神经氨酸酶的活性可以阻止病毒颗粒的释放,切断病毒的扩散链,因而神经氨酸酶可以成为治疗流行性感冒的一个药物靶点。扎那米韦及奥司他韦均为流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)慢结合抑制剂,对甲、乙型流感病毒均有抑制活性。二者作用的靶点是分布于流感病毒表面的神经氨酸酶,它们分别作用于酶的不同部分,可以抑制成熟的流感病毒脱离宿主细胞,改变流感病毒在感染细胞内的聚集和释放,从而抑制流感病毒在人体内的传播以起到治疗流行性感冒的作用。5抗癫痫机制5.1跨膜域螺旋区体内、外实验均表明,甲型流感病毒对金刚烷胺易产生耐药,耐药与编码M2蛋白基因的单个核苷酸突变有关,与抗性有关的突变主要发生在位于跨膜域α螺旋区的26、27、30、31及34位氨基酸,以31位突变最常见,该区域为金刚烷胺类药物作用靶点。突变株的毒力不降低,仍可在人群中引起感染,约30%的成人及儿童在治疗的第5-7天可分离出耐药株,耐药株对扎那米韦、奥司他韦及利巴韦林仍敏感。5.2扎纳米韦和奥司他韦的药理机制5.2.1glu276的再定位耐药取代特征与病毒型有关。对His(组氨酸)274Tyr(酪氨酸)分子耐药机制研究,发现His274Tyr及His274Phe(苯丙氨酸)变株NA对奥司他韦敏感性降低是因取代氨基酸的侧链大,影响Glu(谷氨酸)276的再定位(奥司他韦结合需Glu276再定位,reorientation)。如以侧链较小的Gly(甘氨酸)、Asn(天冬氨酸)、Ser(丝氨酸)及Gln(谷氨酰胺)取代,则对奥司他韦敏感性增加或不改变,但对扎那米韦敏感性降低。流感病毒A/Tokyo/3/67(H3N2)的His274Tyr取代,不影响对奥司他韦及扎那米韦的敏感性。说明274位氨基酸侧链的体积影响流感N1NA对奥司他韦及扎那米韦的敏感性,但不影响N2NA对奥司他韦及扎那米韦的敏感性。5.2.2h65y和n95s突变CollinsPJ等对有H5N1神经氨酸酶突变基因的酶-药物复合体以及酶特性晶体结构分析后发现,H275Y突变导致了奥司他韦耐药性,N295S突变导致了扎那米韦敏感性下降从而使病毒对其中等程度耐药。由于H275Y突变引致的D344N突变的复合作用,引起了NA活性的增强,使甲型H1N1流感中普遍出现了奥司他韦耐药现象。5.2.3病毒的耐药性2007-2008年及2008-2009年流感流行季在A(H1N1)流感病毒中出现的奥司他韦耐药性现象迅速兴起并扩散全球。美国疾病预防控制中心用NA化学荧光分析统计发现,在以上两个流感流行季中,分别大约有20%和90%的被测试病毒对奥司他韦产生了耐药性(半抑制浓度即IC50大约是敏感病毒的100-3000倍)。Okomo-AdhiamboM等发现,对奥司他韦和帕拉米韦(peramivir)有很高半抑制浓度的病毒,以及对扎那米韦半抑制浓度有所提高的病毒,有H274Y突变的同时,还有D151(D-->E/G/N)和/或Q136(Q-->K)的突变,这两个残基有导致NA1耐药性出现的潜力。有D151的突变,而没有H274Y的突变时,不能在任何针对NA1的试验中提高半抑制浓度,但是,仅有Q136K突变单独存在时,就可以使病毒对扎那米韦(36个折叠)、帕拉米韦(80个折叠)和A-315675(114个折叠)的敏感性降低,但是对奥司他韦的敏感性不降低。HurtAC等研究了澳大拉西亚(一般指澳大利亚,新西兰及附近南太平洋诸岛)和东南亚的季节性A(H1N1)流感的耐药性,发现Gln136Lys(Q136K)突变对奥司他韦的敏感性没有影响,但是可以引起扎那米韦和帕拉米韦敏感性分别大约300个折叠和70个折叠的折合(reduction)。D151和Q136的突变仅仅在MDCK培养的病毒中出现,在与此配对的原始临床样本(33例)中没有出现,提示病毒的这些变化是在细胞培养阶段,细胞培养选择的结果;或者是因为耐药性病毒在初始临床标本中产生的几率很低。HurtAC等和Okomo-AdhiamboM等的研究均表明,在流感病毒自然宿主的体外进行流感病毒的繁殖,可能会引致包括NA突变在内的病毒选择性变化,这些变化影响了病毒对NAI类药物的敏感性,故而可能对药物耐药性的监测和诊断产生影响。HurtAC等称,与敏感型的A(H1N1)流感病毒相比,在MDCK(狗肾上皮样细胞)细胞中,Q136K突变株比野生型病毒表现出更好的病毒适合度(viralfitness),但是在雪貂模型中表现出同样的传染性和可扩散性。5.2.4耐药突变株的发现BaranovichT等发现,2007-2008年流感流行季(influenzaseason)有0.4%的、2008-2009年流感流行季有100%的日本人间流行的A(H1N1)流感病毒有H274Y突变,而且有大于300个折叠的片段缩减。金刚烷胺耐药性在2007-2008年流感流行季62.7%的病毒中出现,在2008-2009年流感流行季0%的病毒中出现。在2008-2009年流感流行季的奥司他韦耐药性病毒中,发现在血细胞凝集素的受体绑定区域均有A193T的替换。体外及临床均发现了病毒神经氨酸酶的耐药变异毒株。有研究发现,奥司他韦治疗患者,1%成人患者及5%儿童患者可分离到耐药株,儿童患者易产生耐药突变,用药第4天即可分离到耐药株。耐药变异毒株的复制能力下降,对小鼠及雪貂的毒力、致病性扎那米韦及传染性均较野株弱,其临床意义不明。6奥司他韦耐药性与人的临床并发症的关系有学者发现,2007-2008年流感流行季在欧洲发现的奥司他韦耐药性A(H1N1)流感病毒的流行病学和临床特征,与2009年4月份开始在全球流行的感染性很高的甲型H1N1流感病毒的流行病学和临床特征相似。DharanNJ等选择了2007年9月30日到2008年5月17日以及2008年9月28日到2009年1月19日两个区间中通过美国公共卫生实验室上报给美国疾病预防控制中心用来追踪疾病进展的病毒样本,研究了感染奥司他韦耐药性病毒的患者与感染了奥司他韦敏感性病毒的患者的数据,以比较这两类患者在人口统计学或流行病学特征、临床症状、疾病严重程度或临床预后方面是否有显著差异,结果未发现两个组在上述