生长调节剂对杉木愈伤组织诱导及再生的影响

生长调节剂对杉木愈伤组织诱导及再生的影响

楠木是马鞭草科的一种大型半落叶树木，产于缅甸、印度、泰国和老挝。柚木具有生长迅速、纹理美观、耐腐抗虫和易于加工等优良特性,被誉为最重要的热带珍贵用材树种之一(White,1991;马华明等,2003)。柚木用途极广,适于制作高档家具、木地板,也适于造船、桥梁以及露天建筑,是世界船舰、军需海航及海港、雕刻、红木家具和贴面板的重要用材(刘进平等,2006)。随着国际市场对柚木需求逐年上升,加上来自天然林的柚木越来越紧缺,自80年代以来,柚木传统出口国如印度、泰国和印尼均已终止柚木的原木出口,目前仅有缅甸仍出口柚木原木,印尼只容许成品出口(马华明等,2003),柚木在市场上十分短缺。我国无柚木天然林分布,现存柚木种质资源基本由国外引进。且柚木幼林期不耐霜冻,国内适合种植的有海南、云南及广东、广西和福建的南部极少数地区(梁坤南等,2011)。选育耐寒抗性柚木优良品种,在偶有霜冻地区推广种植尤为重要,常规育种的周期长、难度大、选择效率低(郑勇奇,2001),转基因技术的应用给柚木无性系耐寒品种创制提供了一条选育途径。尽管20世纪80年代始,国内开展了柚木组织培养研究(王宝生等,1980;曹月华等,1981),经过多年研究,已形成了成熟的适合规模化生产的组培快繁工艺技术(裘珍飞等,2001)。但目前尚未建立合适的再生体系,这很大程度上限制了通过基因工程改良柚木的进程。本文拟通过柚木无性系愈伤组织的诱导与植株再生,建立柚木无性系再生体系,为柚木无性系转基因技术提供支撑。1材料和方法1.1材料表面实验材料为中国林业科学研究院热带林业研究所选育的印度优良无性系71-14,以该无性系无菌组培瓶苗的、不带腋芽的节间茎段为外植体。1.2材料的接种与培养根据单因素试验确定4种植物生长调节剂(6-BA、IBA、TDZ和NAA),各设4个浓度水平:6-BA(0.9、1.1、1.3、1.5mg·L-1)、IBA(0.04、0.08、0.12、0.16mg·L-1)、TDZ(0.02、0.05、0.08、0.11mg·L-1)和NAA(0.8、0.9、1.0、1.1mg·L-1)。用正交设计L16(45),16个处理(组合)(表1),每处理3次重复,每重复6瓶。切取71-14无性系无菌瓶苗长0.5~0.7cm的节间茎段为外植体,每瓶接种5个外植体,每处理共接种外植体90个。以MS为基本培养基,添加蔗糖30g·L-1,琼脂7.0g·L-1,pH调至5.8。高温高压灭菌。接种材料先在25℃恒温箱中暗培养28d,再转入到培养室中进行光培养,光照时间为12h,光强2000lx,温度为(25±2)℃;35d后观察外植体愈伤组织的大小、颜色、质地状况,并统计愈伤组织诱导率和褐化率。1.3愈伤组织的生长愈伤组织诱导率(%)=诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%;分化率(%)=已分化的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数×100%;褐化率(%)=褐化愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%;植株再生系数=再生芽数/形成再生芽的愈伤组织数。所用数据采用GENSTAT和SPSS18.0软件进行方差分析和邓肯多重比较。应用隶属函数法计算,以每个处理多项指标隶属值的平均来评判处理对愈伤组织的诱导能力,平均值越大诱导能力越强。计算公式:M(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)式中,M(Xij)为第i处理j指标的隶属函数值,Xij为第i个处理j指标的测定值,Xjmin和Xjmax分别为j指标的最小和最大测定值。2结果与分析2.1不同浓度生长调节剂对愈伤组织诱导率的影响对16个处理愈伤组织诱导率进行方差分析,结果表明(表2):愈伤组织平均诱导率为75.9%,处理间差异极显著,其中处理3和处理12诱导率分别达到98.16%和84.23%,前者与另外的14个处理差异显著。不同处理对愈伤组织大小影响差异也极显著,其中处理4最大,平均直径为1.78cm,处理7其次,为1.74cm,处理2平均直径最低。从实验设计看,处理4是6-BA浓度水平最低、其他3种生长调节剂浓度水平最高的一个组合,尽管处理4的愈伤组织平均直径最大,但诱导率仅为80.51%,与诱导率最高的处理3差异显著。处理3的诱导率最高,但愈伤组织平均直径仅0.97cm,与平均直径最大的处理4差异极显著,在16个处理中排序倒数第二。处理3愈伤组织诱导率虽高,但平均直径小,不利于下一步的愈伤组织继代。褐化率低有利于愈伤组织继代增殖,16个处理愈伤组织褐化率从0到10.71%,差异不显著。不同生长调节剂浓度水平对愈伤组织的诱导率和平均直径影响表现不同(表3)。6-BA和IBA的不同浓度水平间愈伤组织诱导率差异显著,其中6-BA影响愈伤组织诱导率规律性明显,随着浓度增加,愈伤组织诱导率降低,即低浓度的6-BA更易于诱导愈伤组织;而IBA规律性不明显;TDZ和NAA的不同浓度水平间愈伤组织诱导率差异不显著。TDZ和NAA水平间平均直径差异分别达极显著和显著;而6-BA和IBA水平间差异不显著。4种生长调节剂浓度水平间的褐化率差异均不显著。根据方差分析的显著性和极差大小可知,6-BA和IBA是影响愈伤组织诱导率的主要因素。影响愈伤组织诱导率、平均直径及褐化率大小的排序分别为6-BA>IBA>NAA>TDZ、TDZ>NAA>6-BA>IBA、NAA>TDZ>IBA>6-BA。2.2生长调节剂对愈伤组织的影响不同处理对71-14诱导发现,愈伤组织以致密型居多,占45.8%,而疏松致密型和疏松型分别为23.6%和30.6%。16个处理间三种类型愈伤组织差异均达极显著(表4)。其中处理1、2、3、5、6、9、11、15形成的愈伤组织以致密型为主,占52.1%~85.0%。处理10、14、16形成的愈伤组织以表面疏松,内部致密为主,占50.8%~55.0%;处理4、8形成的愈伤组织以疏松型为主,分别占80.8%和56.7%,其他3个处理的三种类型愈伤组织所占比例相差不大。不同生长调节剂浓度水平对形成愈伤组织的质地影响不一(表5,图1),6-BA、IBA和TDZ不同水平间形成致密型愈伤组织差异极显著,其中TDZ对致密型愈伤影响较大,水平间的极差为38.52%,其次为IBA(30.72%)、6-BA(27.09%),低浓度水平的6-BA和TDZ更易形成致密型的愈伤组织。6-BA对疏松致密型的愈伤组织影响最大,水平间差异极显著,极差为38.67%,随着浓度的增加,疏松致密型的愈伤组织所占比例增大;其他生长调节剂对疏松致密型愈伤组织的形成水平间差异不大。TDZ和IBA则对疏松型的愈伤组织影响较大,水平间差异达极显著,其中TDZ水平间极差为35.81%,随着浓度水平的增加,疏松型愈伤组织比例增大,IBA水平间的极差则为28.9%。根据方差分析的显著性和极差大小,4种生长调节剂对致密型和疏松型愈伤组织影响大小的顺序均为TDZ>IBA>6-BA>NAA;而对疏松致密型愈伤组织影响大小的顺序为6-BA>IBA>NAA>TDZ。节间茎段在诱导培养基上培养14d左右即从切口处长出少量不规则淡黄色愈伤组织(图2:A),60d左右愈伤可达0.5~1.5cm3(图2:B)。致密型愈伤其结构紧致,且呈黄绿色,部分愈伤组织表面有芽冒出(图2:B),继代生长慢;而疏松型愈伤组织呈淡黄色(图2:C),其在继代培养中生长速度极快,但只增大体积,外植体呈黄色,愈伤组织上无绿色芽点,多次继代易褐化;前者和后者分别被称为具再生能力和不具再生能力的愈伤组织。根据愈伤组织类型继代生长情况,以愈伤组织诱导率、愈伤组织平均直径和致密型所占比例采用隶属函数法评定各处理的诱导能力,得出处理1(MS+0.9mg·L-16-BA+0.04mg·L-1IBA+0.02mg·L-1TDZ+0.8mg·L-1NAA)的平均隶属值最大,为0.81,随后依次是处理11、处理3和处理4,分别为0.67、0.65、0.57。处理1是综合3项指标最适宜的生长调节剂组合,其愈伤组织诱导率、愈伤组织平均直径和致密型所占比例分别为80.78%,1.648cm和83.0%。2.3再生苗和植株生长选择黄绿色致密愈伤组织接入10个TDZ浓度的分化培养基上进行再生诱导,约30d可见绿色芽点逐渐分化成再生植株,及时去掉无芽点的愈伤组织块,并继代2次后,芽点再生苗增多,茎干粗壮,颜色嫩绿,叶片开始舒展(图2:D),部分再生苗苗高为3~5cm(图2:E)。再分化培养50d时,部分再生植株高而且健壮。通过不同浓度TDZ对愈伤组织再生率的方差分析表明,TDZ对于不同愈伤组织的不定芽分化和植株再生系数均有显著影响。当TDZ浓度为0.066~0.132mg·L-1时,不定芽分化效果相对较好(表6),分化率为26.42%~36.54%,且分化出的不定芽大部分能正常生长,其中TDZ浓度为0.132mg·L-1时,愈伤状态和再生苗长势表现最好。3不同来源的外植体愈伤组织的诱导效果热带林木树种植物组织培养常采用6-BA、NAA、IBA进行愈伤组织诱导和植株再生,如桉树(卜朝阳,2004)、相思(姬明,2006)、土沉香(汪腾跃等,2012)等,早期国外如Noerhadetal.(1980),Rosilahetal.(2005)、Kushalkaretal.(1996)柚木的组织培养研究也多采用6-BA、NAA、IBA。近20~30a一种新型植物生长调节剂TDZ逐渐被应用于组织培养中(裘珍飞等,2009)。对柚木愈伤组织的诱导,单一生长调节剂可能不起作用,国内郭彦彤等(2012)用0.5~2.0mg·L-1NAA诱导同一71-14无性系,结果无法获得愈伤组织,而与6-BA共同作用,则诱导率达40.0%~86.7%,6-BA和NAA各水平差异极显著,它们间的交互作用也达极显著。基于这一点,本研究采用6-BA、NAA、IBA、TDZ设计4因素4水平的正交实验,结果显示,各个处理(组合)对71-14愈伤组织的诱导率为52.27%~98.16%。对愈伤组织的诱导率影响最大的激素为6-BA,且低浓度6-BA的诱导率显著高于高浓度的6-BA,与郭彦彤结果较吻合;Bagheletal.(2008)和Widiyantoetal.(2005)认为最具有再生能力的愈伤组织是浅黄色或浅绿色的致密型愈伤组织,且从该类型的愈伤组织获得柚木再生植株。本研究得出最适宜诱导71-14无性系愈伤组织的为处理1(MS+0.9mg·L-16-BA+0.04mg·L-1IBA+0.02mg·L-1TDZ+0.8mg·L-1NAA),可获得较高的诱导率、较大及易于分化的愈伤组织。TDZ对71-14无性系愈伤大小和致密型质地影响最大,难于再生的植物应用TDZ可获得体细胞胚及再生植株。如Widiyantoetal.(2005)用TDZ和IBA诱导柚木愈伤组织;Akrametal.(2008)用TDZ诱导丛生芽可使诱导率达100%。本研究采用10个浓度梯度的TDZ进行愈伤组织植株再生研究发现,TDZ能诱导愈伤组织的不定芽分化,分化率为15.39%~36.54%,再生系数为0.95~2.23,处理间的差异达显著。尽管这两个指标不高,但能从愈伤组织获得再生植株,并初步选出分化率和再生系数较佳的浓度,即MS+0.132mg·L-1TDZ,其愈伤生长状态和再生植株苗的长势最好。在愈伤诱导过程中,基因型不同是影响实验结果的一个重要因素。即使是来自同一种源不同个体,因基因型不同,对同一生长调节剂的敏感性不同。郭彦彤等(2012)发现柚木同一种源的两个无性系71-5和71-14诱导愈伤组织要求的浓度范围不一致。至于不同来源的外植体所建立的再生体系之间可能更难完全具备可重复性。本研究曾参考Akrametal.(2009)和郭彦彤等(2012)获得的培养基配方进行试验,但效果不理想,形成的愈伤组织量少,水泽化,并在持续培养中愈伤极易褐化死亡。柚木愈伤组织诱导及分化是再生体系建立和基因工程的前提。本研究通过激素和培养基的优化,建立柚木无性系71-14愈伤组织再生体系,初步解决了胚性愈伤组织诱导率低,几乎无进一步分化等难题,为后期建立高效再生体系提供技术支持,也为建立柚木遗传转化体系奠定了基础。但植株再生分化率仍较低,最高仅36.54%,达不到直接进行转基因的条件。这是由于木本植物再生率低、难度大,无性系植株再生难度更大,其外植体与其他胚性外植体(Akrametal.,2008,20