国家自然科学基金-模板

申请代码：C140303受理部门：收件日期：受理编号：国家自然科学基金申请书(2023版)您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的平安性设为:"中"方法:Word菜单->工具->宏->平安性->平安级,设置为"中"(如果您是Word97用户，继续执行以下步骤)2)关闭本文档，重新翻开本文档3)点击"启用宏"按钮，即可开始填写本文档或打印了亚类说明：附注说明：工程名称：血红素加氧酶-1介导Th17细胞在哮喘气道炎症中的免疫调节作用申请者：夏振炜托单位：上海交通大学通讯地址：上海市卢湾区瑞金二路197号邮政编码：200025单位82电子邮件：xzw63@hotmail申报日期：200FORMTEXT8年FORMTEXT1月FORMTEXT25日国家自然科学基金委员会根本信息ykKr4oHP申请者信息姓名性别男出生年月1963年7月民族汉族学位博士职称研究员主要研究领域气道炎症免疫调子邮件xzw63@hotmail个人网页工作单位上海交通大学/医学院附属瑞金医院在研工程批准号30570798依托单位信息名称代码20003001联系人张艳电子邮件jhk-jyb82网站地址合作单位信息单位名称代码00000000项目基本信息工程名称资助类别面上工程亚类说明附注说明申请代码C140303:炎症C1705:儿科学基地类别预计研究年限2023年1月—2023年12月研究属性应用根底研究申请经费34.0000万元摘要(限400字)：FORMTEXT目前认为支气管哮喘是以Th2分泌的细胞因子所致炎性细胞浸润为主的慢性气道炎症。近年研究发现，一类新的Th细胞亚群-Th17，具有调控Th1和Th2的作用。Th17主要分泌IL-17，迄今发现有6种亚型〔IL-17A-F〕。在哮喘气道炎症中，IL-17A/F可促发中性粒细胞性炎症，而IL-17E能促进Th2反响，诱导并激发嗜酸性粒细胞性慢性炎症，但具体机制尚未说明。血红素加氧酶-1〔HO-1〕是血红素代谢的限速酶，作为保护蛋白，具有抗氧化应激和抗炎作用。课题组最近研究说明HO-1高表达后可明显减轻气道炎症和气道高反响性；预实验显示：经血红素诱导HO-1表达可影响IL-17分泌。因此本课题设想通过Th17培养和构建小鼠哮喘模型，分析血红素干预前后Th17及其分泌的细胞因子IL-17变化，探讨HO-1、Th17和哮喘三者关系，说明HO-1抗炎作用机制并提供临床防治新思路。关键词(用分号分开，最多5个)FORMTEXT血红素加氧酶-1；Th17；白介素-17；哮喘；炎症工程组主要成员〔注:工程组主要成员不包括工程申请者，国家杰出青年科学基金类工程不填写此栏。〕编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电子邮件工程分工每年工作时间〔月〕11964-02-01男副教授博士OregonHealthandScience〔53〕494-8188zhangzi@课题设计实验指导421974-12-08男主治医师硕士上海交通大hww1208@163细胞培养细胞因子测定431983-03-12女博士生学士上海交通大eptune312@163动物造模细胞因子测定841982-09-15女硕士生学士上海交通大uiying811012@163细胞鉴定与功能检测851977-06-01男博士生硕士上海交通大adoctor4172@126细胞培养因子测定661978-09-09女主治医师硕士上海交通大ichee78@tom实验指导471957-05-29女技师其他上海交通大uiyifen@163细胞培养689总人数高级中级初级博士后博士生硕士生FORMTEXT=ffdMmb_seniorno+ffdMmb_middle_no+ffdMmb_juniorno+ffdMmb_postdrno+ffdMmb_drcanno+ffdMmb_mscanno88FORMTEXT2FORMTEXT2FORMTEXT1FORMTEXT0FORMTEXT2FORMTEXT1说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报〔含申请者〕，总人数自动生成。经费申请表〔金额单位：万元〕科目申请经费备注〔计算依据与说明〕一.研究经费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb3:b3)+sum(tbl_budgetb9:b9)+sum(tbl_budgetb12:b12)+sum(tbl_budgetb15:b16)25.925.9000FORMTEXT1.科研业务费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb4:b8)7.97.9000FORMTEXT〔1〕测试/计算/分析费FORMTEXT3.0000FORMTEXTWesternblot、ELISA、Real-TimePCR等测试〔2〕能源/动力费FORMTEXT1.7000FORMTEXT1FORMTEXT水、电、煤费用，按5%计〔3〕会议费/差旅费FORMTEXT2.0000FORMTEXT参加国际、国内会议〔4〕出版物/文献/信息传播费FORMTEXT1.2000FORMTEXT文献检索、论著发表费〔5〕其它FORMTEXTFORMTEXT2.实验材料费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb10:b11)1818.0000FORMTEXT〔1〕原材料/试剂/药品购置费FORMTEXT18.0000FORMTEXT质粒构建，T细胞别离纯化柱、别离Kit、试剂盒、Balb/C和DO11.10小鼠〔2〕其它FORMTEXTFORMTEXT3.仪器设备费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb13:b14)00.0000FORMTEXT〔1〕购置FORMTEXTFORMTEXT〔2〕试制FORMTEXTFORMTEXT4.实验室改装费FORMTEXTFORMTEXT5.协作费FORMTEXTFORMTEXT二.国际合作与交流费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb18:b19)33.0000FORMTEXT1.工程组成员出国合作交流FORMTEXTFORMTEXT2.境外专家来华合作交流FORMTEXT3.0000FORMTEXT邀请协作者来华交流路费和住宿费三.劳务费FORMTEXT3.4000FORMTEXT研究生劳务费四.管理费FORMTEXT1.7000FORMTEXT组织实施费，按5%计合计FORMTEXT=sum(tbl_budgetb2:b2)+sum(tbl_budgetb17:b17)+sum(tbl_budgetb20:b21)3434.0000FORMTEXT与本工程相关的

其他经费来源国家其他方案资助经费FORMTEXT其他经费资助〔含部门匹配〕FORMTEXT5.0000其他经费来源合计FORMTEXT=sum(tbl_budgetc23:c24)55.0000报告正文〔一〕立项依据与研究内容：工程的立项依据支气管哮喘是最常见的呼吸道慢性炎症性疾病之一，随着生活水平不断提高及生活方式西方化，该病呈不断上升趋势，成为危害人类身体健康的主要疾病之一，给社会带来巨大的经济负担。支气管哮喘因长期、反复慢性炎症可导致气道重塑，严重影响肺功能，因此说明其发病机制并早期、有效的控制哮喘气道炎症是临床与科研丞待解决的问题。支气管哮喘发病机制十分复杂，涉及肺组织中抗原递呈细胞、树突状细胞、T辅助细胞〔Thelpcells,Th〕和调节性T淋巴细胞〔regulatoryTcells,Treg〕及其相互作用。目前认为过敏原促进初始Th0细胞向抗原特异性Th2细胞定向分化，建立以Th2细胞占优势的T细胞免疫应答反响，导致Th1/Th2比例失衡。Th2分泌细胞因子如白介素〔interleukin,IL〕-4、-5和-13等，一方面进一步促进Th0细胞向Th2细胞分化，另一方面作用于B淋巴细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞〔eosinophil,EOS〕，诱发以EOS浸润为主的慢性气道炎症和气道高反响性〔哮喘的两个重要特征〕。在慢性气道炎症的根底上，又因过敏原暴露及感染等诱因导致中性粒细胞和单核细胞在肺部大量募集，产生大量氧自由基，引起哮喘急性加重[1-3]。而哮喘的反复急性发作和气道慢性炎症持续状态那么导致气道结构破坏与修复交替反复，引起平滑肌增生，最终导致气道重塑。但研究发现，一类新的Th细胞亚群－Th17细胞，在哮喘气道炎症的发生开展中起重要作用。Th17细胞是新近提出的一类独立的Th细胞亚群，不同于Th1〔分泌IFN-和TNF-〕和Th2〔分泌IL-4、IL-5和IL-13〕细胞，因分泌IL-17而命名，又称为产生IL-17的效应性T淋巴细胞〔IL-17producingeffectorTcells〕。该类细胞分泌的细胞因子能够趋化中性粒细胞、单核细胞等，促进炎症的发生，在自身免疫性疾病中起着主导作用，故成为目前研究的热点[4-6]。关于Th17细胞的起源、分化尚未明确，目前认为Th17起源于初始Th0细胞，在TGF-β、IL-6的协同作用下分化为Th17细胞[7-9]，其中IL-23对维持并扩增该细胞亚群具有重要作用，而IL-4和IFN-协同作用可抑制Th17分化[4]〔图1〕，新近研究说明IL-27亦可抑制Th17分化[10]。图1Th17细胞分化示意图Th17细胞以CD4+T细胞为主，又称为细胞毒性T细胞抗原8〔CTLA-8〕[11]，主要通过分泌IL-17发挥作用[4]，其中人IL-17为同源二聚体蛋白，其氨基酸序列与松鼠猴疱疹病毒的开放阅读框〔HSVS13〕有58%的同源性。迄今IL-17家族已发现6种亚型〔IL-17A-F〕，分泌的IL-17由2个32kDa同源二聚体构成。Th17细胞分泌的IL-17主要为IL-17A和IL-17F〔IL-17A/F〕。体内IL-17通过与细胞膜上IL-17受体〔IL-17R〕结合而发挥作用。IL-17R是一种Ⅰ型跨膜蛋白，含864个氨基酸，在气道上皮细胞、人表皮成纤维细胞、人胚肾细胞、B细胞、髓单核细胞、CD56+外周血NK细胞、外周血单个核细胞上均有表达，而IL-17A/F主要与IL-17RA受体结合[4,12]，可激活3条经典MAP激酶信号传导途径，包括ERK1、ERK2、JNK和P38，引起IL-6和IL-8的分泌，从而导致中性粒细胞在局部的募集，包括浸润气道引发哮喘。IL-17还可触发NF-B，导致T细胞增殖，并上调众多炎症介质基因如NOS和IL-1等的表达，亦可促进粒细胞生成因子分泌，导致骨髓、脾脏中粒细胞数量增加[4,12-14]。因而在众多炎症如哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎及实验性自身免疫性脑炎等，IL-17表达显著升高[15]。进一步研究发现，先前认为由Th1细胞造成的免疫性疾病实际由IL-17所致，而且IL-17在过敏性疾病中的作用亦逐渐被认识。因此，IL-17在哮喘中的作用愈来愈受到重视。一方面，IL-17可协同趋化中性粒细胞和单核细胞募集的细胞因子IL-8、GROα、GCP-2和刺激骨髓粒细胞增生的细胞因子IL-6、GSF、GM-CSF和诱导单核细胞的IL-1和TNF-等作用，促进中性粒细胞、单核细胞生成并在肺部募集，增强其功能和生存时间，引起肺部炎症〔图2〕。研究发现在图2Th17细胞在气道炎症中的作用哮喘急性发作和哮喘职业病，中性粒细胞起了重要作用。因而认为IL-17A/F参与了以中性粒细胞浸润为主的哮喘发生[1,3]。在过敏性哮喘动物模型中，Naruhito等[16]采用分子克隆技术，体外构建小鼠pcDNAmIL-17F质粒，并将其导入OVA致敏小鼠肺组织中，结果发现在OVA激发后支气管肺泡灌洗液〔bronchialalveolarlavagefluid，BALF〕内中性粒细胞和单核细胞显著增加，小鼠对乙酰胆碱的气道反响性明显增高，粘蛋白基因表达增强；Peter等[17]对OVA致敏小鼠经IL-17抗体干预后发现BALF内中性粒细胞显著减少，提示IL-17A/F参与了由过敏原诱导的气道高反响性。但IL-17A/F对引起气道慢性炎症的主要炎症细胞－EOS那么具有相反的作用。研究发现，通过质粒转染诱导IL-17基因在局部高表达或局部给予重组IL-17蛋白后，随着中性粒细胞的增加，EOS并未增加甚至减少，而给予IL-17单克隆抗体后随着局部中性粒细胞的减少，BALF及骨髓中EOS却显著增加，血清及BALF中IL-5显著升高[15-17]。最新研究报道：IL-17E能促进Th2反响，诱导并激发EOS性慢性炎症，因此IL-17E与以EOS浸润为主的气道炎症和气道高反响性密切相关，但Th17是否分泌IL-17E有待进一步明确。在过敏性哮喘患者和动物模型的血、痰液和BALF中，IL-17mRNA与蛋白含量均显著升高。Silvia等[18]采用IL-17R基因剔除小鼠建立哮喘模型，发现IL-17R缺陷小鼠气道炎症明显减轻，BALF中EOS减少，血清抗原特异性IgE水平降低，体外肠系膜淋巴细胞培养并经特异性抗原刺激后IL-5产生减少，提示IL-17又与哮喘严重程度呈正相关[15-19]。血红素加氧酶〔hemeoxygenase,HO〕是哺乳动物和人体内血红素代谢途径中的限速酶，将血红素四吡咯环上的甲基桥裂解，最终形成等量的胆绿素及CO并释放铁原子。随之，胆绿素经胆绿素复原酶作用形成胆红素。目前发现HO有三种同工酶，为不同基因产物：即诱导型HO-1，组成型HO-2及新近发现的异构体HO-3。三种同工酶的氨基酸序列和诱导性各异，但具有共同的催化底物反响机制和反响产物。HO-1分子量为33kDa，由288个氨基酸构成，为热休克蛋白32〔HSP32〕。血红素，金属元素，氧化应激，紫外照射，化合物，高温，某类药物，复原型谷胱甘肽等均能诱导HO-1，分布在肝脏、脾脏、肺脏等组织。HO-2由361个氨基酸构成，分子量为36kDa，HO-2不受外因诱导，在脑和睾丸中浓度最高。HO-3是一个约2.4kb的单一转录产物，分子量约33kDa，分布在脾脏、肝脏、胸腺、前列腺、心脏、肾脏、大脑和睾丸组织中。HO-3类似于HO-2，但催化活性极低。与HO-1、HO-2相比，HO-3代谢血红素的能力较弱，推测可能对血红素依赖性的反响过程有调节作用。至今HO-3生理功能尚未明确，相关的研究报道亦甚少。大量根底和临床实验证明HO-1作为保护蛋白，表达后具有抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡和抗平滑肌增生等重要功能[20-24]，在许多疾病如支气管哮喘[22-24]等中发挥其保护作用，其在多种疾病中的潜在治疗意义也越来越受到重视[25,26]。新近研究发现HO-1抗哮喘气道炎症作用主要表现为：①减少炎症细胞在局部的浸润。研究说明，上调HO-1表达可以抑制单核细胞浸润。②抑制促炎因子如TNF-、IL-1β、MIP-1β、GM-CSF的产生[27,28]。此类因子相互作用，募集众多炎性细胞，进而又促使各种炎性介质、细胞因子释放，使气道炎症加剧，触发并放大炎症效应；而HO-1通过抑制前炎症因子释放从而阻断这一重要环节，起到抗炎作用。③促进抗炎细胞因子IL-10的释放，抑制Th2细胞因子的分泌和IgE的产生，促进EOS凋亡和减轻抗体介导的EOS炎症[29]。④稳定肥大细胞，抑制肥大细胞脱颗粒及白细胞粘附于血管内皮上。⑤抑制粘附分子在血管内皮细胞上的表达。Almolki发现在卵清蛋白〔ovalbumin,OVA〕诱导的豚鼠哮喘模型经血红素〔hemin〕上调HO-1基因表达那么明显减轻气道炎症反响；反之，用HO-1抑制剂锡-原卟啉〔Sn-protoporphyrin,SnPP〕后那么逆转该反响[22]。另有报道显示HO-1和CO能抑制平滑肌增生，阻止气道重塑。但HO-1通过何种细胞发挥免疫调节作用至今未见确切的报道。课题组近期的研究结果显示：①在OVA致敏、激发的哮喘小鼠，经Hemin上调HO-1表达后，肺脏和脾脏中foxp3表达及蛋白量增加，血清IL-10增高，而OVA特异性IgE水平降低，肺脏病理组织学检测、BALF中细胞总数和EOS计数均显示炎性细胞尤其是EOS浸润减少；CD4+CD25+Treg功能抑制试验发现，OVA致敏、激发Balb/C小鼠经Hemin干预后，抑制作用显著增加；SnPP能逆转HO-1作用。IL-10剔除的B6.129P2-Il10tm1Cgn/J小鼠Treg抑制作用经Hemin干预后仍未改善。研究说明：HO-1可能经诱导CD4+CD25+Treg特异性转录因子foxp3表达，激活CD4+CD25+Treg，促进IL-10分泌，以拮抗哮喘气道炎症[23,24]；②预初实验同时显示：体内经Hemin诱导HO-1高表达后能明显降低由抗CD3/CD28抗体刺激后脾细胞分泌IL-17，而单独或加用SnPP后IL-17分泌增加，提示HO-1在体内具有先前未知的抑制IL-17的免疫调节作用〔图3〕，但具体机制尚需进一步探讨。此外我们已建立了小鼠哮喘动物模型，免疫斑联〔ELISPOT〕方法测定IL-17表达，掌握了应用OVA多抗原肽〔multipleantigenicpeptide,MAP〕免疫小鼠来获得大量OVA特异性Th17细胞，并通过尾静脉注射进行细胞移植，结果详见工作根底。为本工程的开展奠定了根底。图3Hemin抑制体内抗原非特异性IL-17分泌鉴于HO-1和Th17细胞在支气管哮喘中的作用，结合我们前期工作根底，我们认为HO-1可能介导了Th17细胞分泌不同IL-17亚型，并在哮喘发生、开展中发挥作用。本工程拟在HO-1表达干预前后，通过体外别离、培养OVA抗原特异性Th17细胞，观察HO-1对Th17细胞和IL-17等细胞因子的影响；并建立OVA致敏、激发的Babl/C小鼠哮喘模型，采用细胞荧光标记技术标记Th17细胞，Th17细胞回输OVA致敏后的Babl/C小鼠，通过免疫荧光、流式细胞分析技术研究Th17细胞在哮喘动物模型中的作用，探讨HO-1、Th17细胞和哮喘气道炎症三者关系，说明HO-1抗炎作用机制并提供临床防治新思路〔图4〕。图4HO-1与Th17细胞作用示意图参考文献[1]RichardM,Effrosa,HariNagarajb.Asthma:newdevelopmentsconcerningimmunemechanisms,diagnosisandtreatment.CurrentOpinioninPulmonaryMedicine2007,13:37-43[2]JohanssonSGO,HourihaneJO’B,BousquetJ,etal.Arevisednomenclatureforallergy.AnEAACIpositionstatemen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各组IL-17mRNA表达水平。ELISA方法测定各组细胞因子IL-17A/F、IL-17E、IL-4、IL-10和IFN-γWestern-blot测定各组HO-1的表达量和酶活性〔本方法实验室已建立〕。小鼠IL-17引物和Taqman探针序列〔本实验室已合成〕分别为：IL-17A正向引物：5'-GCTCCAGAAGGCCCTCAGA-3'IL-17A反向引物：5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGA-3'IL-17ATaqman探针：5'FAM-CTCTCCACCGCAATGAAGACCCTGA-TAMRA3'IL-17E正向引物：5'-CACACTGCGTCAGCCTACAGA-3'IL-17E反向引物：5'-TGTGGTAAAGTGGGACGGAGTT-3'IL-17ETaqman：5'FAM-CTCCCACATGGACCCGCTGGG-TAMARA3'二、体内实验1．制备小鼠哮喘气道炎症模型选用本课题组已建立的哮喘模型〔Zhen-WeiXia,etal.TheJournalofImmunology,2006,177:5936-5945〕。Balb/C小鼠〔上海斯莱克实验动物有限责任公司〕腹腔注射OVA〔Sigma公司〕2次致敏，间隔2周，以及腹腔麻醉后经OVA气道局部激发，诱导哮喘气道炎症。2．HO-1表达干预前后肺组织Th17细胞及其IL-17等细胞因子的变化与哮喘气道炎症设对照组、OVA组、OVA+Hemin组、OVA+SnPP组和OVA+Hemin+SnPP组。Balb/C小鼠于OVA致敏前2天，前1天，致敏后第12、13、23、24和27天分别经腹腔注射Hemin、SnPP和Hemin+SnPP各75mol/kg干预HO-1表达，Western-blot检测各组HO-1的表达量和酶活性，同时各组进行以下实验：2.1分析Th17细胞和IL-17不同亚型及相关细胞因子在肺组织中分布与表达①免疫荧光检测Th17细胞在肺组织中的分布：分别于OVA致敏和激发后3、6、12、24、48和96h处死动物，肺组织冰冻切片，依次参加FITC标记的抗小鼠CD4抗体和APC标记的IL-17A抗体〔eBioscience公司〕，荧光显微镜下观察CD4+IL-17+细胞比例。②Realtime-PCR检测IL-17A、IL-17E在小鼠肺组织中的表达：别离小鼠左肺即刻置液氮中，－80℃保存；或匀浆肺组织，TRIzol提取总RNA，1μgRNA逆转录，Realtime-PCR扩增并测定各组小鼠肺组织IL-17mRNA表达水平。小鼠IL-17引物和Taqman探针序列③肺组织IL-17等细胞因子检测：分别于OVA致敏和激发后3、6、12、24、48和96h，采血并切开气管，注入0.3ml冰冻生理盐水灌洗3次，收集BALF於1500g离心5min，离心留取上清，ELISA方法测定BALF中IL-17A/F、IL-17E、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β和IFN-γ水平，比拟不同时间点上述指标的变化〔eBioscience公司〕。2.2构建小鼠pAcGFP1-pIL-17A、E启动子质粒，经脂质体包埋后导入肺部，观察由IL-17启动子激活的AcGFP1荧光蛋白表达，分析HO-1干预在OVA激发后不同时间点IL-17A、IL-17E表达①构建小鼠pAcGFP1-pIL-17A、E启动子质粒：别离Balb/C小鼠外周血单个核细胞，提取DNA，PCR扩增小鼠IL-17A、IL-17E启动子序列〔5'端和3'增加EcoRI序列和3个保护碱基-CCGIL-17A启动子上游引物：5'-CCGGAATTCAGGGTATCCCAAGAAGTGTCAGA-IL-17A启动子下游引物：5'-CCGGAATTCTCCCTGGACTCATGTTTGCGCGT-EcoRI限制性内切酶酶切PCR扩增产物和pAcGFP1质粒，T4连接酶连接启动子序列和pAcGFP1质粒，构建含IL-17A启动子的pAcGFP1-pIL-17A质粒，转染DH5，用含庆大霉素的LB培养皿筛选并扩增质粒，QIAminiprep〔Qiagen〕试剂盒抽提并纯化质粒，获得纯化的pAcGFP1-pIL-17A质粒〔本实验室构建完成〕。采用克隆IL-17A相同的方法扩增小鼠第14号染色体上IL-17E转录起始位点上游2kbDNA序列作为IL-17E启动子序列，将其克隆入pAcGFP1质粒，构建pAcGFP1-pIL-17E启动子质粒。②观察OVA激发后不同时间点IL-17A、IL-17E表达情况：脂质体包埋pAcGFP1-pIL-17A、E启动子质粒，在OVA激发同时分别将10、20和30μg/ml质粒经气道导入肺部，激发后3、6、12、24、48和96h处死动物，肺组织冰冻切片，荧光显微镜下观察pAcGFP1表达情况，从而动态分析OVA激发后IL-17A、IL-17E在肺2.3IL-17A、IL-17E抗体或重组蛋白干预对小鼠哮喘气道炎症和气道高反响性的影响各组小鼠在OVA激发同时气道内分别给予5μgIL-17A、IL-17E单克隆抗体和/或0.1μgIL-17A、IL-17E重组蛋白干预〔RnDsystem〕，24h后病理组织学检测；ELISA方法测定BALF中细胞因子IL-17A/F、IL-17E、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β和IFN-γ水平；流式细胞仪〔BIO-RAD公司〕分析肺组织中Th17细胞数，并测试气道反响性以评价IL-17A、2.4Th17细胞回输对小鼠哮喘气道炎症和气道高反响性的影响选用100μgOVA323-329肽段的MPA-OVA免疫DO11.10小鼠持续2天，别离胸腺细胞，参加TGF-β、IL-6和IL-23体外培养〔方法同上〕，并用CMTMR荧光标记〔红色〕，该方法在OVA刺激下能产生大量OVA特异性Th17细胞。于OVA激发前24h将1×107致敏胸腺细胞〔OVA特异性Th17细胞〕经尾静脉回输5组Balb/C小鼠，24h后OVA气道激发，并于激发后3、6、12、24、48和96h处死动物，病理组织学检测；ELISA方法测定BALF中细胞因子IL-17A/F、IL-17E、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β和IFN-γ水平；流式细胞仪〔BIO-RAD公司〕分析肺组织Th17细胞数，并测试气道反响性以评价IL-17在哮喘中的作用。3．HO-1表达干预前后血清Th17、CD4+CD25+Treg细胞和IL-17等细胞因子的变化5组Balb/C小鼠于OVA气道激发后3、6、12、24、48和96h采血50μl，分别参加FITC标记的抗小鼠CD4抗体和PE标记的IL-17A抗体〔eBioscience公司〕；APC标记的抗小鼠CD4抗体、PE标记的抗小鼠CD25抗体(BDPharmingen公司)和FITC标记的抗小鼠foxp3抗体(eBioscience公司)，流式细胞仪(BIO-RAD公司)测定Th17和CD4+CD25+Treg细胞比例，数据采用CellQuest软件分析。ELISA方法测定血清中细胞因子IL-17A/F、IL-17E、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β和IFN-γ水平。研究方案及技术路线〔见图〕可行性分析鉴于HO-1和Th17细胞在过敏性哮喘发生开展中的重要性，目前急需建立一个Th17细胞的研究平台，以此来进一步明确Th17细胞在哮喘中的作用，以及HO-1和Th17间作用关系。因此本工程设想通过体外细胞培养和哮喘动物模型来说明HO-1和Th17细胞间的相互作用，为哮喘的发生机制和防治提供理论根底和临床手段是一种新思路。具体方案中涉及哮喘模型的建立：课题组已成功建立了以OVA腹腔注射致敏结合气道内局部激发的小鼠哮喘模型，结果显示气道内大量炎性细胞浸润，并在吸入乙酰胆碱后表现出明显气道高反响性；更重要的是预初实验已说明IL-17在此模型中有显著变化，由此相信选用该模型来研究HO-1干预前后Th17细胞及其分泌的IL-17的变化是可行的。课题组已与OregonHealthandScienceUniversityDr.Zhang实验室建立了长期合作协议，相关的研究人员已在其实验室开展工作。Dr.Zhang实验室已建立MAP技术，合成了大量OVA323-339肽段。该技术特点能利用多个赖氨酸组成一个核心分子，在此根底上通过胺键结合大量特异性抗原肽段，从而提高抗原表达性。DO11.10小鼠是一类转基因小鼠，基因背景为Balb/C小鼠，其T细胞对OVA具有特异性识别和反响性。我们前期研究发现，给DO11.10小鼠注射带有OVA的MAP后能在胸腺和脾脏诱导大量抗原特异性Th17细胞，把获得的Th17细胞荧光标记经尾静脉回输到Balb/C小鼠，通过眼内注射OVA激发24h后可见荧光标记细胞。该方法为我们进行细胞输注和动态监测提供了保障〔图5〕。图5MAP-OVA分子结构示意图〔注：Lys赖氨酸〕Th17细胞的测定：本实验室与Dr.Zhang实验室建立了利用免疫斑联技术结合流式细胞技术分析Th17细胞功能和IL-17的表达；并在小鼠1号染色体上克隆出IL-17A启动子，利用分子克隆技术构建了小鼠pGL3-pIL-17A启动子质粒，该质粒在特异性刺激T细胞后能激活由IL-17A启动子控制的Luciferase蛋白活性，通过特异性方法可以检测到这一变化。将pGL3-pIL-17A启动子质粒转染人纤维母细胞IL-2免疫效应：我们前期研究发现，给小鼠注射小鼠重组IL-2蛋白能提高外周CD4+CD25+foxp3+Treg细胞的表达，并进一步抑制IL-17的产生。这个结果为我们后续开展Th17免疫抑制实验提供了依据。因此，本课题从设想、设计至采用研究方法、技术路线均完全可行，能够获得预期结果。本工程的特色与创新之处选用哮喘动物模型以及分子克隆技术结合活细胞荧光标记及跟踪技术等研究HO-1和Th17细胞在哮喘发生开展中的作用，说明HO-1介导Th17细胞以抑制哮喘气道炎症是本工程的特色和创新之处。年度研究方案及预期研究结果研究方案度2023.01~2023.12：OVA特异性Th17细胞制备和培养；HO-1表达干预前后表达量和活性测定以及Th17细胞及其IL-17等细胞因子检测。2023.01~2023.12：哮喘动物模型构建；HO-1表达干预，质粒构建转染、抗体或重组蛋白干预和细胞回输，肺组织Th17及IL-17等相关细胞因子测定。2023.01~2023.09：哮喘动物模型构建；HO-1表达干预前后血清Th17、CD4+CD25+Treg细胞和IL-17等细胞因子测定。2023.10~2023.12：补充相关研究内容，资料总结、鉴定，参加国际国内学术会议与交流。预期研究结果选用支气管哮喘动物模型，在HO-1表达干预前后通过体内外实验，探讨HO-1、Th17细胞及其分泌的IL-17在支气管哮喘发生开展中的作用；分析Th17细胞和IL-17不同亚型水平变化，说明HO-1介导Th17细胞拮抗哮喘气道炎症，以祈提出哮喘发病的新机制、早期和有效控制哮喘的新思路。培养博士、硕士研究生2~3名；组织申报国际合作工程1项，并在高影响因子的SCI发表论著2篇。〔二〕研究根底与工作条件1、工作根底相关的研究工作积累本工作是在原承当的4项国家自然科学基金工程〔编号：39600159、30170988、30471833和30570798〕所取得发现的根底上的延续。申请者自1988年起开展大鼠和人HO及其同工酶结构与功能研究，近几年的工作主要为：①大鼠血红素加氧酶〔rathemeoxygenase,rHO〕-1cDNA克隆，rHO-1cDNA的定点突变及表达质粒pcDNA3HO-1，pcDNA3HO1△25的构建、转染，表达产物大鼠变异体HO-1活性检测。相关论文分别发表在《WorldJGastroenterol》、《实验生物学报》和《临床儿科杂志》。②人血红素加氧酶〔humanhemeoxygenase,hHO〕-1变异体的制备和结构与功能研究。通过野生型hHO-1〔whHO-1〕和His25Ala突变体hHO-1〔hHO-1〕构建，X-衍射晶体结构分析和酶活性测定，探讨了hHO-1分子结构和催化底物血红素反响的功能。相关论文分别发表在《PediatrTransplantation》、《实验生物学报》、《临床儿科杂志》和《现代免疫学杂志》。③应用siRNA抑制HO-1mRNA表达以降低胆红素水平的研究。通过设计并化学合成针对人和大鼠HO-1基因4组小分子干扰RNA〔smallinterferingRNA,siRNA〕。经INTERFERin转染、流式细胞仪检测、RT-PCR方法筛选出最正确抑制效果的siRNA，并作用于构建的新生鼠黄疸模型。结果说明，运用分子生物学技术设计合成的siRNA能够有效抑制HO-1基因表达，最终减少胆红素产生。相关论文分别发表在《ExperimentalBiologyandMedicine》和《细胞生物学杂志》。④探讨HO-1介导CD4+CD25+Treg拮抗哮喘气道炎症的作用。用OVA致敏、激发小鼠制备并建立哮喘动物模型，并在致敏、激发过程中经Hemin或SnPP处理。分别测定激发后各组动物血清OVA特异性IgE，BALF中细胞总数和EOS数及外周血CD4+CD25+Treg细胞变化和肺组织HO-1和foxp3mRNA表达量，结合病理组织学分析气道炎病症况。结果显示：OVA组、Hemin组、SnPP组血清OVA特异性IgE和BALF中细胞总数及EOS数明显高于正常对照组，但Hemin组IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数明显低于OVA组；而OVA组和SnPP组间IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数无显著性差异；病理组织学显示OVA组、Hemin组和SnPP组气道组织均见EOS浸润，但Hemin组气道炎症仍明显轻于OVA组和SnPP组；Hemin组外周血CD4+CD25+Treg细胞比例及肺组织foxp3mRNA相对表达量明显高于OVA组。Hemin显著上调HO-1表达。实验说明：用Hemin诱导HO-1高表达后外周血CD4+CD25+Treg细胞比例及foxp3mRNA相对表达量明显升高，同时血清OVA特异性IgE明显下降，BALF中细胞总数和EOS数减少，气道炎症减轻；提示HO-1可通过提高CD4+CD25+Treg细胞比例并增强其功能来调节体内Th1/Th2平衡,在支气管哮喘中起到保护作用。相关论文分别发表在《TheJournalofImmunology》、《TheAmericanJournalofPathology》和《中国科学》。⑤有关HO-1与T淋巴细胞在免疫性疾病中的作用综述，申请者已在《CurrentPharmaceuticalDesign》发表。已取得的研究工作成绩就本工程的开展，课题组已进行了以下预初实验：(1)哮喘动物模型构建动物：6-8周雌性Balb/C小鼠，具体步骤：致敏阶段：第0，14天使用OVA100μg＋Al(OH)3100μg腹腔注射，第14天用30μl含100μgOVA的生理盐水经鼻滴入。激发阶段：第25、26和27天用30μl含50μgOVA的PBS经鼻滴入，建立小鼠哮喘动物模型。该动物模型出现明显气道炎症和气道高反响性。结果显示OVA激发后肺组织内大量炎性细胞浸润。(2)小鼠pGL3-pIL-17A启动子质粒构建和活性测定①pGL3-pIL-17A启动子质粒构建目标基因序列构建：别离Balb/C小鼠外周血单个核细胞，提取DNA，PCR扩增小鼠IL-17A启动子序列。扩增引物：5'-ACGCGTCCTTCCCATCTACCTTCG-3'上游引物参加MluI序列；5'-AAGCTTTCCCTGGACTCATGTTTGC-3'下游引物参加HindIII序列。产物：246bp。酶切：MluI/HindIII酶切PCR扩增产物和pGL3Basic质粒。连接：T4DNA连接酶连接IL-17启动子序列和pGL3质粒，构建pGL3-pIL-17A质粒。转染、筛选、扩增、纯化：pGL3-pIL-17A质粒转染DH5，氨卞青霉素筛选，扩增，QIAminiPrep鉴定：酶切构建质粒，1％琼脂糖电泳分析酶切产物〔图6〕。图61％琼脂糖电泳分析酶切产物②pGL3-pIL-17A启动子质粒pGL3-pIL-17质粒转化纤维母细胞：用Exgen500体外转染试剂盒将pGL3-pIL-17质粒导入纤维母细胞，在PMA和ionomycin刺激下用Wallac酶标仪测定荧光强度，结果提示pGL3-pIL-17质粒转化后荧光强度显著增强〔图7〕。图7pGL3-pIL-17质粒转化纤维母细胞经刺激后荧光强度显著增强(3)OVA323-339MAP合成OVA323-339MAP由PortlandVAMedicalCenter设计合成，OVA323-339氨基酸序列为：ISQAVHAAHAEINEAGR〔图5〕。目的是利用多个赖氨酸组成一个核心分子，并通过胺键结合大量特异性抗原肽段，从而提高抗原表达性。(4)OVA特异性Th17细胞制备及回输给6-8周雌性DO11.10小鼠连续2天腹腔注射100μg/只MAP-OVA或非OVA-MAP，并注射PBS作为对照，第3天处死动物，取下脾脏和胸腺保存于培养液中〔RPMI164010%FBS青霉素100U/ml链霉素100μg/ml〕，用70μMStrainer别离脾细胞和胸腺细胞，稀释细胞浓度至4×106/ml〔脾细胞〕或2×106/ml〔胸腺细胞〕，各取100μl稀释后细胞行Elispot分析，在不同时间点〔0、6、12、24、36、48和60h〕参加OVA323-339肽段刺激〔终浓度为7.5μg/ml〕，分析OVA特异性IL-17分泌。结果提示MAP-OVA注射后胸腺细胞可产生大量OVA特异性IL-17〔图8和9〕。另外，分别别离MAP-OVA和PBS腹腔注射2天DO11.10小鼠脾脏细胞，37℃下用25μMCMFDA〔一种绿色荧光〕标记30min，PBS洗涤后稀释成4×107细胞浓度，0.2ml经尾静脉输入，同时眼内注入100μgOVA〔4μl〕，24h动物异氟醚持续吸入麻醉状况下荧光显微镜观察眼内幕胞浸润情况〔图10〕图8Elispot分析OVA刺激引起胸腺细胞抗原特异性IL-17分泌的时间曲线图9Elispot分析OVA刺激引起胸腺细胞抗原特异性IL-17分泌图10荧光标记脾细胞经尾静脉输入后眼底改变(5)Hemin诱导HO-1高表达影响IL-17预初实验体内经Hemin诱导HO-1高表达后显示由抗CD3/CD28抗体刺激的脾细胞分泌IL-17显著减少，而单独或加用HO-1酶抑制剂SnPP后IL-17分泌增加，提示HO-1在体内具有先前未知的抑制IL-17的免疫调节作用〔图3〕。2、工作条件①上海交通大学医学院附属瑞金医院儿科哮喘中心成立已8年，围绕HO-1结构与功能以及支气管哮喘的发病机制，课题组已先后承当6项国家自然科学基金资助工程和多项上海市科委工程，具备了一定工作根底，确保了本工程的实施。②儿科实验室具备了质粒克隆、表达，细胞培养、免疫荧光和酶活性检测等技术条件。③课题组已成功建立了以OVA腹腔注射致敏结合气道内局部激发的小鼠哮喘模型，结果显示气道内大量炎性细胞浸润，并在吸入乙酰胆碱后表现出显著气道高反响性。④课题组与OregonHealthandScienceUniversityDr.Zhang实验室建立了长期合作协议，相关的研究人员已在其实验室学习，保证了本工程的实施。3、申请人简介夏振炜研究员博士生导师1995年毕业于上海交通大学医学院〔原上海第二医科大学〕获儿科学博士学位；1998年日本金泽医科大学综合医学研究所人类遗传学研究部门为外籍研究员。获2003年度“第四期上海市引进海外高层次留学人员专项资金〞三类资助。现为上海市医学会儿科专业委员会临床免疫学组委员，担任《临床儿科杂志》、《中国新生儿科杂志》和《中国微循环》杂志编委。在HO及其同工酶的结构、SnPP抑制HO活性降低胆红素水平以及HO-1在支气管哮喘中的抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡作用等方面开展了系列研究。先后负责国家自然科学基金资助工程4项、上海市科委工程2项、上海市教委重点工程和开展基金工程各1项。培养硕士研究生10名，博士研究生2名。近五年以第一作者或通讯作者发表论著17篇。第一作者或通讯作者论著Z.W.Xia,W.W.Zhong,J.S.MeyrowitzandZ.Zhang.TheRoleofHemeOxygenase-1inTCell-MediatedImmunity:TheAllEncompassingEnzyme.CurrentPharmaceuticalDesign2023，14(5)：454-64Zhen-WeiXia,Li-QingXu,Wen-WeiZhong,Jing-JingWei,Ning-LiLi,JieShao,Yun-ZhuLi,Shan-ChangYu,andZi-LiZhang.HemeOxygenase-1AttenuatesOvalbumin-InducedAirwayInflammationbyUp-RegulationofFoxp3T-RegulatoryCells,Interleukin-10,andMembrane-BoundTransformingGrowthFactor-1.TheAmericanJournalofPathology2007，171：1904-1914Zhen-Wei,Xia,Chun-eLi,You-XinJin,YiShi,Li-QingXu,Wen-WeiZhong,Yun-ZhuLi,Shan-ChangYu,andZi-LiZhang.ReductionofBilirubinbyTargetingHumanHemeOxygenase-1ThroughsiRNA.ExperimentalBiologyandMedicine2007，232：495-502Zhen-WeiX,Jian-LeS,QiQ,Wen-WeiZ,Xue-HongZ,Zi-LiZ.Hemeoxygenase-1improvesthesurvivalofdiscordantcardiacxenograftthroughitsanti-inflammatoryandanti-apoptoticeffects.PediatrTransplantation2007，11：850-859Zhen-WeiXia,Wen-WeiZhong,Li-QingXu,Jian-LeSun,Qing-XiangShen,Ji-GuangWang,JieShao,Yun-ZhuLi,andShan-ChangYu.HemeOxygenase-1MediatedCD4+CD25highRegulatoryTCellsSuppressAllergicAirwayInflammation.TheJournalofImmunology2006，177：5936-5945须丽清，钟文伟，李宁丽，邵洁，李云珠，俞善昌，夏振炜*.血红素加氧酶-1可能经诱导foxp3+CD4+CD25+Treg细胞抑制哮喘气道炎症.中国科学2007，37(2)：152-162李春娥，金由辛，史毅，须丽清，钟文伟，申庆祥，李云珠，俞善昌，夏振炜*.用siRNA沉默人血红素加氧酶-1基因降低胆红素水平.细胞生物学杂志2007，29：282-290钟文伟，孙健乐，申庆祥，李云珠，俞善昌，夏振炜*.血红素加氧酶-1介导CD4+CD25High调节性T淋巴细胞拮抗哮喘气道炎症的实验研究.中国科学2006，36(2)：157-164钟文伟，孙健乐，邵洁，李云珠，俞善昌，夏振炜*.血红素加氧酶-1抑制哮喘气道炎症的研究.临床儿科杂志2006，1：9-12孙健乐，钟文伟，邵洁，周光文，李云珠，俞善昌，夏振炜*.

血红素加氧酶1延长异种心脏移植存活的机制研究.现代免疫学杂志2006，26(3)：197-202须丽清，钟文伟，李宁丽，邵洁，李云珠，俞善昌，夏振炜*.血红素加氧酶-1上调CD4+CD25+Tregfoxp3表达以增强Treg的免疫抑制功能.现代免疫学杂志2006，26(6)：469-476孙健乐，钟文伟，邵洁，李云珠，俞善昌，夏振炜*.血红素加氧酶-1抗急性血管排斥反响的作用研究.上海医学2005，28(8)：643-646夏振炜，齐奇，张雪洪，申庆祥，李云珠，俞善昌.大鼠HO-1表达质粒构建、活力检测及抗HUVEC凋亡的作用研究.实验生物学报2005，38(5)：441-446夏振炜，钟文伟，李云珠，俞善昌，崔文俊，周文普，张雪洪.制备hHO-1突变体以降低胆红素水平实验研究.临床儿科杂志2005，7：472-476齐奇，周文普，张雪洪，徐宇虹，夏振炜*.血红素加氧酶-1抗人血管内皮细胞凋亡的实验研究.临床儿科杂志2005，8：574-576XiaZW,ZhouWP,CuiWJ,ZhangXH,ShenQX,LiYZ,YuSC.Thestructurepredictionandtheactivityanalysisofhumanhemeoxygenase-1anditsmutant.WorldJGastroenterol2004，10(16)：2352-6夏振炜，周文普，张雪洪，李云珠，俞善昌.hHO-1结构预测及突变体的构建、表达、纯化和活性检测.实验生物学报2004，37(5)：375-83获奖情况人员名单：俞善昌、李云珠、陈舜年、夏振炜、贲晓明、杭杲、李佩红、高正仪、王愚珍奖励名称：新生儿高胆红素血症与胆红素神经毒性的系列研究奖励等级：上海市科委科技进步三等奖授奖年：2000年合作者简历张自力博士，AssistantProfessor1988年毕业于上海第二医科大学医学系，1996年在北卡州立大学获得博士学位，于1996-1999年分别在北卡州立大学皮肤药理及毒理学研究中心、路易斯安那州立大学健康和科学中心从事博士后研究，1999年至今分别在路易斯安那州立大学健康和科学中心和俄勒冈州健康和科学大学Doernbecher儿童医院从事小儿消化系统疾病根底和临床研究，现为俄勒冈州健康和科学大学AssistantProfessor，Doernbecher儿童医院StaffPhysician，为北美小儿营养和消化道疾病协会、美国移植协会、眼科和视力研究协会、美国医学研究联盟会员。张自力博士多年来致力于Th17细胞及其IL-17在炎症性疾病中的作用，负责或参与了美国国立儿童健康及人类开展研究院〔NICHD〕基金、NationalInstituteonAlcoholAbuseandAlcoholism〔NIAAA〕基金、CollinsMedicalTrust基金、NEI基金和医学研究基金资助等工程。近年以第一作者或通讯作者在国际杂志上发表论著11篇，并荣获2007年度波特兰市最正确医师称号，获得WesternAmericaMedicalResearchOutstandingInvestigatorAward和YoungInvestigatorAwardofWorldCongressofPediatricGastroenterology等殊荣。同时被聘为主导路易斯安那州立大学健康和科学中心炎症性肠病中心科研工作和GersonLehranan生化公司的技术参谋。第一作者或通讯作者论著1.Z.Zhang,B.P.Peters,andN.A.Monteiro-Riviere.Assessmentofsulfurmustardinteractionwithbasementmembranecomponents.CellBiologyandToxicology1995,11(2):89-1012.Z.Zhang,J.E.Riviere,andN.A.Monteiro-Riviere.Evaluationofprotectiveeffectsofsodiumthiosulfate,cysteine,niacinamideandindomethacinonsulfurmustard-treatedisolatedperfusedporcineskin.ChemicalandBiologicalInteraction.1995,96(3):249-2623.Z.ZhangandN.A.Monteiro-Riviere.Comparisonofintegrinsinhumanskin,pigskin,andperfusedskin:aninvitroskintoxicologymodel.JAppliedToxicolology1997,17(4):247-2534.Z.Zhang,J.Cork,P.Ye,D.Lei,P.O.Schwarzenberger,W.R.Summer,J.E.Shellito,S.Nelson,andJ.K.Kolls:InhibitionofTNF-processingandTACE-mediatedectodomainsheddingbyethanol.JournalofLeukocyteBiology2000,67:856-8625.Z.Zhang,J.K.Kolls,P.Oliver,D.Good,M.Joshi,P.Schwarzenberger,andJ.Lancaster:Activationoftumornecro