化学生物学专业开题报告范例

PAGEPAGE6四川农业大学本科生毕业论文（设计）开题报告毕业论文（设计）题目β葡萄糖苷酶的筛选及其酶学性质和动力学的研究选题类型应用基础型课题来源自选项目学院生命科学与理学院专业化学生物学指导教师黄乾明职称教授姓名冯沁年级2008级学号200858261立题依据近年来，β-葡萄糖苷酶（以下简称简称BGL）作为风味酶的一种，其应用也逐渐得到开发。茶叶、水果中的风味前体物多以糖苷（单帖烯基-β-D-葡萄糖苷）的形式存在，BGL与其它风味酶协同作用于该前体物释放出风味成分。将其应用于（果）酒、茶叶、果汁中可起到增香作用。如李平等人研究发现黑曲霉β-D-葡萄糖苷酶对苹果汁、柠檬汁、茶汁的增香效果良好；而凌建斌研究了BGL对葡萄酒的增香机理。另外，为了提高酶的利用率及使用寿命，人们对不同的酶进行修饰、固定化、或微胶囊化。对BGL固定化技术有许多种，如利用醋酸纤维的纤维包埋法、利用钠玻璃或铅玻璃的载体结合法、利用聚乙烯酸的共价结合法、利用可溶性载体（葡聚糖）的具有酶衍生作用的固定化等等。Cantarella等人将BGL固定在脱乙酰壳聚糖上，应用于造酒工艺中提高酒的香味。而QuanYi等人对BGL进行微胶囊化，并设计了一个生化反应器来利用β-D-葡萄糖苷酶合成辛基和己基-β-D-Glu-copyranoside,发现微胶囊化BGL较用XAD-4固定化BGL的反应速高2.5倍，而且反应条件更为温和。目前，工业上对BGL的主要应用是生产低聚龙胆糖。低聚龙胆聚是龙胆二糖、三糖、四糖的混和物，生产过程中，将高浓度的葡萄糖液用霉菌生产的BGL在较高温度下作用，使葡萄糖发生转移反应和缩合反应来酶法合成低聚龙胆糖。它比麦芽糖浆具有更高的吸水性和较低的粘度，可防止食品中的淀粉老化和保持食品中的水分；不易为人体消化酶所消化，为低热值低聚糖对双歧杆菌具有较强的增殖作用；具有轻微的苦味，特别适合于咖啡制品和巧克力制品中应用，具有增味或味觉改良作用。由于其显著的保健功能，低聚龙胆糖及类似低聚糖类正日益受到消费者的青睐。目前我国低聚糖类的产量仍很小，至于低聚龙胆糖更未见有报导生产。目前世界上生产龙胆低聚糖的唯一公司是NihonShokuhinKako,其商品名为"Gintose",年产量只有300-400吨。β—葡萄糖苷酶葡萄糖苷水解酶，它属于纤维素酶类。是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶。根据其底物特异性将其归类于烃基β—葡萄糖苷酶、纤维二糖酶、或水解烃基-β-糖苷基和寡聚糖的酶类。又据BGL的基因序列的不同有β-葡萄糖苷酶A和β-葡萄糖苷酶B之分。两者尽管同属β-葡萄糖苷酶。但其底物特异性却不尽相同。BGL在自然界广泛分布，几乎在所有的生物体中都有存在，因其来源不同而性质各异，在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。随着从大量嗜热性细菌分离出了BGL后，由于其高度的耐热稳定性及高活性而对纤维质糖化工业极为有利，日益受到人们的重视。与美国，日本等国相比，我国的研究工作主要还在生产菌种的筛选方面，关于其性质，化学结构，催化机制等方面的报导几乎仍是空白。BGL参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用，它把细菌的BGL在酶解纤维素时就起着至关重要的作用，它把由纤维素酶降解生成的纤维二糖和三糖转化成可发酵的葡萄糖。而哺乳动物和人体内的乳糖酶/根皮苷(LPH)水解酶也含有一种芳基-β-葡萄苷酶，LPH因其涉及成人型乳糖酶缺乏病一种常见的人体基因紊乱病而被广泛研究。一直以来，人们认为BGL参与微生物糖代谢的非磷酸途径，Kengen等人研究发现，它其实参与的是EMP糖酵解途径，是参与双歧杆菌糖代谢的有关酶系之一。BGL的另一主要应用是用于降解纤维素。纤维素酶转化纤维成葡萄糖的过程细节和作用机理还不清楚或未有定论。一般认为由内切葡聚糖作用于微纤维的非结晶区，纤维二糖水解酶再从非还原端依次分解产生纤维二糖和三糖，后者再由BGL水解成葡萄糖。纤维素是葡萄糖以β-1，4-键结合聚合物，为植物细胞壁的构成成分，占植物干重的1/2-1/3。全球一年间由光合作用生产的纤维素达1000亿吨，是最丰富的可再生资源。将植物纤维应用于发酵食品工业原料，对人类将是一个重大的贡献，可以使我们摆脱对谷物粮食的绝对依赖，缓和世界资源紧缺。另外，根据BGL的半乳糖酶活力还可将其应用于乳品工业来分解乳糖，与其它酶协同作用生产葡萄糖与单细胞蛋白，以及饲料工业和医药领域等。2研究的主要内容本实验主要对产BGL菌进行筛选及BGL酶活性的测定。3研究方案3.1技术路线土样的采集土样的采集β-葡萄糖苷酶的分离β-葡萄糖苷酶的分离产BGL菌筛选β-葡萄糖苷酶的动力研究测定酶的活性温度范围和最适温度β-葡萄糖苷酶的动力研究测定酶的活性温度范围和最适温度测定酶的活性PH范围和最适PH3.2实验材料与仪器3.2.1****************3.2.2主要生化试剂和*****************3.2.3**************3.2.5***************3.2.6*************3.2.73.3实验方法3.2.1取土样1g，溶于99ml无菌水，配成10-2悬浊液，再逐步稀释成10，10，10，10，各吸取1ml于液体培养基中进行培养，温度为30℃，时间为3d。然后再分别在PDA培养基上按常规涂布方法分离培养3d，获取单菌落。喷涂1mol/L的Na2CO3溶液，挑取有黄色透明圈的单菌落于产酶培养基上30℃培养3d，以纤维二糖及pNPG为底物测各自β-葡萄糖苷酶活力。选择酶活高者为研究菌种。3.3.2产酶培养基发酵培养3d后，加入65ml蒸馏水（与培养前加入的Mandels营养液35ml总体积为100ml，即固液比例约为1：14）于40℃水浴浸提1h，压滤取滤液，在4℃下于3500r/min冷冻离心20min，取上清粗酶液备用。3.3.3粗酶上样到预先用柠檬酸-磷酸缓冲液（0.02mol/L，PH5.0）平衡的SephadexG-150柱（2.5×90cm）。收集β-葡萄糖苷酶活力峰，超滤浓缩除盐后，上样到相同缓冲液平衡的DEAE-SephadexA-50柱（3.3×30cm），用0～0.4mol/LNaCl线性梯度洗脱（2×500ml）。收集高活力蛋白峰，超滤除盐后，上样到想通缓冲液平衡的DEAE-SephadexA-50柱（2.0×30cm），用0～0.3mol/LNaCl梯度洗脱3.3.43.3.4.1标准曲线的制作：分别吸0.1%葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0毫升于试管1、2、3、4、5、6号，用蒸馏水将每支试管加水到1ml，再加1mLDNS试剂，充分混合后在沸水中煮沸5分钟，冷却后用蒸馏水稀释至10ml，用7230分光光度计在波长540nm处测其OD值，以1号试管为对照。取0.5ml一定稀释度的样液，加入0.5ml0.5%的水杨苷（溶于0.1MpH=4.8醋酸缓冲液中），55℃保温20分钟后，加入1mlDNS试剂，充分混合在沸水中煮沸5分钟，冷却后用蒸馏水稀释至10ml，在7230型分光光度计上于540nm处测OD值，以加热灭活的酶液按照同样方法处理作为空白。上述条件下，定义每小时由底物产生1umol还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶活单位（u）。3.3.4.2取0.5ml一定稀释度的样液，加入0.5ml0.5%的水杨苷（溶于0.1MpH=4.8醋酸缓冲液），55℃保温5、10、20、25、30、40、50、60分钟，分别加入1mlDNS试剂，充分混合后在沸水中煮沸5分钟，迅速冷却，用蒸馏水稀释至10ml，在入=540nm处测OD值，作图。3.最适pH是在不同pH缓冲液(0.1mol/L柠檬酸-磷酸缓冲液pH2～8,0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液,pH9-1)中测定,以水杨苷为底物;pH稳定性的测定是先使酶在上述缓冲液中20℃保温24h,再测定活力.最适温度是在pH4.8,0.1mol/L的醋酸缓冲液中测定,温度范围4～80℃,温度稳定性测定按文献[2]测定,先使酶在不同温度保温30min，然后按3.在pH4.8,0.1mol/L醋酸缓冲液中,分别用0.3～3mmol/L8个不同浓度水杨苷,纤维二糖,对硝基酚-β-葡萄糖苷为底物。按3.3.4测定酶活力.米氏常数的测定Lineweaver-Burk作图法。pH对动力学参数的影响按3.3.5条件测定,以水杨苷为底物。4预期研究结果4.1确定β-葡萄糖苷酶活性最佳的最适条件通过研究找出β-葡萄糖苷酶活性最佳的最适pH、温度。4.2初步探索*****************************。5论文进度安排第一阶段：2011.*-2011.*，β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选；第二阶段：2011.*-2011.*，β-葡萄糖苷酶的分离；第三阶段：2011.*-2011.*，酶活测定；第四阶段：2011.*-2011.*，pH和温度适应性与动力学测定；第五阶段：2011.*-2011.*，对本项研究进行讨论、分析、评估、整理、撰写论文。参考文献[1]杨胜远，刘玉燕，梁智群。β-葡萄糖苷酶产生菌的分离筛选。工业微生物，2002，32（4）：36～38[2]孙迎庆，曹淑贵，韩四平。β-葡萄糖苷酶的分离纯化和性质研究。中国生物化学与分子生物学报，1998，14（1）：82～86[3]顾卫民，郭海风，沈爱光。β-葡萄糖苷酶产生菌、发酵条件的优化粗分离及其特性研究。江苏食品与发酵，2001，4：12～16指导教师意见指导教师签名：