喜树WRKY 转录因子的克隆

喜树WRKY转录因子的克隆CloningofCamptothecaacuminataDecneWRKYtranscriptionfactor-PAGEI-注：页眉，居中，楷体，五号。此文本框。摘要注：页眉，居中，楷体，五号。此文本框。喜树是我国特有的树种，喜树中的喜树碱以及衍生物具有极其重要的药用价值，但喜树的分布范围较窄，喜光不耐严寒，且喜树中的喜树碱含量低，这些问题就导致了市场喜树碱供不应求。为了解决这一问题，研究人员对喜树生长方式以及喜树碱合成方式进行了深入探究，WRKY转录因子在植物生长发育和抵抗外界不良环境侵害中发挥着重要的作用，近年来，研究人员已在葡萄、茶树、樟树、玉米、丹参、西红柿、铁皮石斛等十几种植物中克隆出来WRKY转录因子并对转录因子的表达进行了深入研究，但从喜树中克隆出来WRKY转录因子的报道很罕见。本课题是研究如何在喜树中克隆出WRKY转录因子，在本课题中，首先找到生长状况良好的喜树，选择喜树的嫩叶，提取喜树的总RNA，对提取得到的RNA检测其完整度，选取完整的RNA进行下一步实验，利用RT-PCR技术将喜树RNA反转录成第一链cDNA，设计引物，以该cDNA为模版和正反引物通过PCR技术扩增得到我们需要的喜树WRKY转录因子，PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后对目的条带进行胶回收，加A并与pGM-T载体连接，将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布于LB+Amp固体培养基上培养，进行蓝白斑筛选，挑取白斑扩大培养后，白色菌落进行菌落验证，将阳性克隆子进行扩大培养后提质粒，酶切检测，送测序。关键词：喜树；WRKY转录因子；逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）；聚合酶链式反应（PCR）AbstractCamptothecinanditsderivativeshaveextremelyimportantmedicinalvalue.However,camptothecinhasanarrowdistributionrange,itisnottoleranttocold,andcamptothecincontentincamptothecinislow.Theseproblemsleadtotheshortageofcamptothecininthemarket.Inordertosolvethisproblem,researchersonxitreegrowthwayandthesyntheticwayofcamptothecindelveinto,WRKYtranscriptionfactorsinplantgrowthandresistancetooutsidebadenvironmentplaysanimportantrole,inrecentyears,researchershavebeeningrape,teatree,camphortrees,suchascorn,salviamiltiorrhiza,tomato,tincaulisdendrobiidozensofclonedWRKYtranscriptionfactorsinplantsandtheexpressionoftranscriptionfactorsincarriedonthethoroughresearch,butfromthetreeofxiclonedreportsofWRKYtranscriptionfactorsarerare.ThissubjectistostudyhowtocloneinxitreeWRKYtranscriptionfactors,inthistopic,firstfindtreegrowthingoodconditionofxi,chooseliketreeleaves,treeoftotalRNAextractionxi,theextractionofRNAtodetectitsintegrity,selectcompleteRNAintothenextphaseoftheexperiment,usingRT-PCRtechnologywillbelikeatreefirstchainRNAreversetranscribedintocDNA,primerdesign,andreverseprimerforthecDNAtemplateandweneedliketreeisobtainedbyPCRamplificationWRKYtranscriptionfactor,thePCRamplificationproductbyagarosegelelectrophoresisbandsforpurposesofplasticrecyclingaftertesting,Awasaddedandlinkedwithpgm-tvector,andtherecombinantplasmidwastransformedintoescherichiacolicompetentcells,whichwerecoatedonLB+Ampsolidmediumforculture,andthenblue-whitespotscreeningwascarriedout.Afterthewhitespotwasselectedforextendedculture,thewhitecolonywasverifiedbycolonyverification,andthepositivecloneswereexpandedforcultureandplasmidextraction,enzymedigestiontestandsequencing.KeyWords：Camptothecaacuminata;WRKYtranscriptionfactor;RT-PCR;PCR

目录TOC\o"1-3"\h\z题目：喜树WRKY转录因子的克隆 1喜树WRKY转录因子的克隆 2摘要 IAbstract II引言 1第一章文献综述 31.1喜树 31.1.1喜树碱功能及其作用机制 31.1.2喜树碱的来源以及合成 41.2WRKY转录因子家族 61.2.1WRKY转录因子的结构 71.2.2WRKY转录因子的功能分析 81.3WRKY转录因子在其他植物中的克隆 91.4实验流程简述 10第二章材料和方法 122.1实验材料 122.1.1实验材料 122.1.2实验试剂和酶 132.1.3实验仪器 142.1.4实验体系和培养基 152.1.5实验主要技术 错误!未定义书签。2.2实验方法 192.2.1前期操作准备及说明 192.2.2克隆目的基因 21第三章试验结果与分析 283.1喜树RNA完整度的检验 283.2蓝白斑筛选 293.4菌落验证 293.5酶切检测 323.5试验分析与讨论 33结论 34参考文献 35致谢 38-PAGE2-引言本文是以喜树WRKY转录因子为研究对象，目的是成功克隆出喜树WRKY转录因子。喜树作为中国特有的树种，主要分布在长江流域以南的地区，喜树（旱莲木）是珙桐种，属于落叶乔木,高可达30余米，喜树对外界生长环境有一定的要求，喜光喜湿暖环境，不耐严寒，不耐干燥，较耐水湿，深根性，萌芽率强。喜树的化学成分复杂多样，其中喜树碱是由研究人员从喜树中分离得到的一类色氨酸-帖烯类生物碱，将其命名为喜树碱，喜树碱具有较强的抗肿瘤活性，在临床上被应用于肺癌、肝癌、消化道癌、膀胱癌、白血病以及淋巴肉癌等，喜树的这种药用价值被人们发现并引起了关注。本课题所研究的WRKY转录因子是高等植物中最大转录因子家族之一，是一类DNA结合蛋白，大多数的植物中都有这一重要的转录因子，它参与着植物的生长发育过程、应激性信号传递、多种基因及转录因子的交叉调节过程等[1]。WRKY转录因子的DNA结合结构域被称为WRKY结构域，这个特殊的结构域使得转录因子具有不同的调控功能。第一个WRKY转录因子是从甘薯中克隆被出来的，被命名为SPF1，从那时起，WRKY转录因子的克隆、功能分析等研究向前迈进了一大步，研究人员们陆续从多种植物中克隆了WRKY转录因子，例如茶树、樟树、西红柿、葡萄、拟南芥、大麦、黄瓜、松树、烟草、杨树、水稻、铁皮石斛等等。WRKY结构域能够特异性识别W-BOX序列[2]，WRKY结构域与W-BOX序列特异性结合，然后调控相关基因的表达，进而调节植物的生长发育，W-BOX序列（(T)(T)TGAC(C/T)），TGAC是这个序列的核心[8]，相关试验证明若这个核心发生改变，哪怕仅仅是一个氨基酸位置发生变化，WRKY结构域与该序列就难以成功结合，说明该序列是高度保守的。除此之外，这种特异性的结合需要金属离子的参与，其中Zn2+是目前发现能够有效催化结合的二价阳离子，这种结合还需磷酸化过程，该结合还受相关试剂的抑制，例如EDTA、1，10-邻菲咯啉可以抑制这种特异性结合，蛋白激酶抑制剂、碱性磷脂酶能够解除这种特异性结合。WRKY家族作为最大的转录因子家族之一，参与了植物众多生理生化过程并且在其中扮演了重要角色，由于WRKY转录因子家族是非组成型表达的，它的表达受时期、部位、环境影响、具有时空特异性，植物不同的生长时期、根、茎、花、叶、果实、高温、低温、湿润、干燥，它的表达都呈现不同的趋势，它还受到许多因子的诱导，例如病原入侵、衰老、损伤等。WRKY转录因子的调控还具有组织特异性，调控速度快，时间短。它在植物防御应答过程，衰老过程、发育代谢以及非生物胁迫中的都发挥着关键作用。到目前为止，WRKY转录因子的功能在许多植物中已经被发现且研究人员们成功在植物中克隆出了WRKY转录因子，并对其进行了详细的生物学研究，但关于喜树WRKY转录因子克隆及功能分析还没有详细的报道，需要进一步的研究。第一章文献综述1.1喜树喜树（Camptothecaacuminata），又叫旱莲、千丈树、水桐树等，蓝果树科、喜树属，落叶乔木，高可达20多米，叶片薄且具有纸质感，小枝呈圆柱形，树皮浅灰色或灰色，不同生长时期的树皮颜色有差异，树皮上有纵裂的浅沟壑，喜树的花序像球形，为淡绿色，雌花顶生，雄花腋生，果实为黄褐色，花期为5至7月，果期9月。喜树通常生长在海拔1000米以下的地区，喜光，喜欢温暖湿润的生长环境，不耐严寒干燥，但对于土壤的酸碱度没有严格的要求，萌芽率强，在湿润的溪河堤岸边都能生长良好，是我国特有的植物，长江以南地区喜树较为常见，喜树因其珍贵的药用价值以及在我国特有的优势被列入了重点保护的野生植物名单。喜树的每一个部位都有药用价值，它的根、叶、树皮、果实、树枝都可以入药，主要是抗肿瘤的生物碱成分在发挥功效，在临床上被应用于肺癌、肝癌、消化道癌、膀胱癌、白血病以及淋巴肉癌等的治疗，外用也可治疗牛皮癣。喜树的果实、根以及树皮的醇提取物可以抑制动物抑制性肿瘤，而其中所含的喜树碱及其衍生物是具有一定的抗癌作用的。1.1.1喜树碱功能及其作用机制喜树中的重要成分喜树碱具有较强的抗癌活性以及免疫抑制作用等。喜树碱在破坏肿瘤细胞的DAN结构的同时又抑制DNA聚合酶从而影响DAN的复制。在细胞周期中，对于DNA合成前期以及合成后期（G1、G2）细胞有一定的作用，对DNA合成期（S期）具有明显的抑制作用，而对于细胞阻留状态的细胞（G0）没有作用。相同浓度的喜树碱体外培养肿瘤细胞和大鼠的肝细胞，结果发现肿瘤细胞的DNA和RNA的合成被抑制，而肝细胞则不受抑制，实验证明，喜树碱对肿瘤细胞的抑制作用明显地大于对正常细胞的作用，验证了喜树碱的抗肿瘤活性。喜树碱除了抗肿瘤活性外还具有抑制体外疱疹病毒的作用。1.1.2喜树碱的来源以及合成喜树碱最初是从喜树中分离得到的，从而命名为喜树碱，但由于喜树碱在喜树中的含量很低，且喜树分布范围较窄且生长缓慢，所以研究人员们陆续也从其他植物中分离得到了喜树碱，例如夹竹桃科的海木狗牙花、茜草科的短小蛇根草、以及茶茱萸科的臭味假柴龙树等16中植物中检测到喜树碱及其衍生物的存在，这为喜树碱资源匮乏，来源单一的问题提供了解决方向。除此之外，通过基因工程的手段，改变植物次生代谢途径的遗传特性，从而改进植物次生代谢产物的量以及品质，这也是提高喜树碱产量的有效方法之一，主要包括关键酶基因工程和相关转录因子两大方面。图1.1.2喜树碱的合成途径根据喜树碱合成途径，我们可以通过改造这途径中的某些关键酶基因来影响喜树碱的合成。BAX是一种细胞凋亡基因，研究人员把BAX基因转入喜树愈伤组织，结果发现喜树碱以及10-羟基喜树碱的含量提高了，实验证明，BAX虽然是细胞凋亡因子，但是它会促使植物次生代谢产物的含量增加[34]。TDC在一定程度上也可以使喜树碱的含量增加，实验测得TDC过表达的转基因细胞株中的喜树碱含量确实有所增加。研究人员利用基因沉默技术诱导喜树内源合成途径上游的G10H、HGO、TDC1和STR沉默，发现喜树碱的含量明显降低，利用RNA干扰技术使得TDC1和CYC1表达受到抑制，结果发现受抑制表达的喜树碱含量大大降低。除了内源关键酶基因的改造，研究人员还尝试了外源酶基因的转入，将长春花的G10H和STR基因转入喜树的毛状根，结果发现喜树碱的含量竟然提高了3.8倍之多。喜树内源关键酶基因的改造和转入外源关键酶基因对次生代谢产物含量都有较为明显的影响，除了影响关键酶基因的表达还可以利用基因工程技术调控转录因子以达到影响次生代谢产物产量的目的。转录因子是一类能够识别并结合启动子元件进而调控相关基因的表达的一类蛋白质分子。目前为止研究人员们发现长春花中的CrMYCs、CrWRKYs、CrZCTs、CrORCAs等转录因子会影响生物碱的次生代谢，WRKY、P2/ERF类、bZIP以及锌指类转录因子参与调控萜类的合成。而目前对于喜树中的转录因子调控喜树碱的生物合成的报道较为罕见。长春花与喜树具有相似的MIAs生物合成途径，长春花中有一种响应于茉莉酮酸的APETALA2(AP2)结构域的转录因子，称为ORCA3，ORCA3能够增强萜类吲哚生物碱生物合成途径中某些关键基因的转录，将ORCA3转入到喜树毛状根中后，喜树碱的含量提高了1.5倍，这种转入外源转录因子的方法成功影响了喜树碱的合成，这说明通过利用转录因子实现对喜树碱合成的调控是可行的，通过这种方法培育优良的转基因植株代替野生型植株，进而获取更多且优质的喜树碱。1.2WRKY转录因子家族在植物转录因子家族中，WRKY转录因子家族是较大的一支，虽然在一些低等原生动物中也有发现WRKY蛋白，但是在植物中广泛存在着WRKY基因，故而形成了一个大的转录因子家族，WRKY转录因子广泛参与植物的生物与非生物胁迫的调控，自2003年在拟南芥中鉴定了72个WRKY转录因子，并且其中有49个参与植物的病害防御之后，许多技术运用到分析植物WRKY转录因子的研究中，例如实时定量PCR(qRT-PCR)、RNA测序(RNA-seq)、微阵列芯片(Microarray)等。2013年之后，植物全基因组测序WRKY转录因子家族的研究报道日益丰富，WRKY转录因子家族的结构功能也越来越为人们所知晓，目前为止，对于WRKY转录因子的研究依然在不停的向前推进。1.2.1WRKY转录因子的结构WRKY结构域的N端含有一段高保守序列WRKYGQK，其C端是锌指结构CX4-5CXnHXH/C(X为任意氨基酸)。根据WRKY结构域的数量以及锌指结构的不同可将庞大的WRKY家族分为三大类，第一类是含有两个WRKY结构域，有CX4-5CX22-23HX1H的锌指结构，这一类的代表有SPF1、ABF1、PcWRKY1等，在低等原生动物中发现的WRKY蛋白就属于这一类，这类的两个结构域主要是C端的WRKY结构域起作用；第二类是只含有一个WRKY结构域，其锌指结构与第一类相同，N端的WRKY结构域与第一类相似，大多数的WRKY都属于第二类，例如AtWRKY1、ABF2、NtWIZZ等；第三类与第二类一样只含有一个WRKY结构域，不同的是它的锌指结构是特殊的CX7CX23HX1C，这类的代表有NtWRKY4、NtWRKY5、AtWRKY70等[8]。图1.2.1拟南芥全长WRKY蛋白的结构图和家族分类图1.2.2WRKY转录因子的功能分析植物转录因子大家族之一的WRKY转录因子是众多信号网络的重要一份子，参与着植物许多生理调控过程，例如种子发育、毛状体发育、胚胎发生、营养不足、衰老、植物激素应答、病害防御等多种生长发育生理过程。在拟南芥中发现了一个与植物发育相关的转录因子TTG2/AtWRKY44，该转录因子主要在植物的表皮毛、种皮和根尖中表达，同时该转录因子也是被发现的第一个与形态建成有关的WRKY转录因子；受病原菌诱导表达的转录因子AtWRKY75也与植物的生长发育相关，研究表明该转录因子能够调节根的发育，与此同时它还在植物衰老过程中发挥作用。植株在衰老早期表达转录因子AtWRKY53，研究发现，过表达AtWRKY53的植株出现了早衰的现象，而在RNAi和插入突变AtWRKY53抑制表达的植株中并没有出现这种现象，反而延迟了衰老过程，这证明AtWRKY53确实影响了植物衰老过程；AtWRKY6也是一个与衰老有关的转录因子，研究人员在分析了幼叶、成熟叶和衰老叶三种植物不同生长时期的叶片中该转录因子的表达情况后，发现在衰老的叶片中AtWRKY6的表达水平明显的高于幼叶和成熟叶，这表明AtWRKY6的确参与植物衰老过程；此外，AtWRKY70也是参与植物衰老的一员，不同的是AtWRKY70是一个负调节因子，AtWRKY70功能的缺失会导致植物加速衰老。当植物遭到外界病原菌侵害时，自身的免疫系统会启动防御程序，这种免疫应答过程十分复杂，包括许多基因的表达，WRKY转录因子在这个免疫应答过程中起着十分重要的调节作用。上述提到的在植物衰老过程中的负调节因子AtWRKY70在植物病原菌防御中也是重要一员，参与SA（Salicylicacid水杨酸）和JA(jasmonicacid茉莉酸)调节的防御信号途径，SA诱导AtWRKY70的表达，而JA会抑制它的表达。当过表达AtWRKY70时，拟南芥会增加对病原菌Pst的抗性，当抑制AtWRKY70表达时，拟南芥对E.c.carotovora的敏感性会增加[8]，实验证明了WRKY转录因子的表达对植物免疫应答具有重大影响。在拟南芥的72个WRKY转录因子中有49个都参与了病原菌的防御过程，除了AtWRKY70、AtWRKY33之外还有AtWRKY52、AtWRKY62、AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60等等。除了拟南芥，在其他物种中WRKY转录因子也有出色表现，在水稻中，OsWRKY71的过表达植株增加了对细菌病原菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)13751的抗性，OsWRKY71受到SA、MeJA、ACC、以及病原侵染的诱导。OsWRKY45在水稻面对非生物胁迫时诱导表达，同时也受ABA(abscisicacid脱落酸)和病原菌侵染的诱导而高表达[18]，过表达OsWRKY45的植株再增加了对病原菌的抗性的同时也提高了对不良环境（高盐、干旱）的耐受能力。总而言之，WRKY转录因子在植物自我防御上发挥了极其重要的作用。1.3WRKY转录因子在其他植物中的克隆铁皮石斛同喜树一样也是一类珍稀药用植物，研究人员们进行了铁皮石斛WRKY5基因的克隆试验，对其进行了生物学信息分析。通过转录组测序和反转录PCR两个方法相结合的方法第一次在铁皮石斛中克隆得到一个WRKY基因，实验结果获得长1336bp的DoWRKY转录因子cDAN全长序列,开放阅读框（ORF）834bp,共计编码氨基酸残基277个[15]，DoWRKY属于第二类WRKY转录因子。DoWRKY在铁皮石斛的根、茎、叶中都有表达，在叶中的表达量最高。DoWRKY在ABA胁迫、蔗糖渗透胁迫、不同低温下都可以被诱导而高表达，该实验结果证明了DoWRKY基因在铁皮石斛应对低温恶劣环境以及其他非生物胁迫中起着至关重要的作用，这对于培育抗寒品种的铁皮石斛提供了实验基础以及研究方向。茶树作为喜温、喜湿植物，同喜树一样对于生长环境具有一定条件，冻害、高温、干旱等不良因素会对其的生长造成极大的伤害，造成茶叶的产量质量下降的问题。研究人员成功在铁观音茶树中克隆了的8个WRKY基因，并详细分析了这8个WRKY基因的表达，，这八个WRKY转录因子的ORF长度为1407、2208、1302、849、978、879、1443和810bp，分别编码468、735、433、282、325、292、480和269个氨基酸[19]。这八个WRKY基因在干旱、低温、ABA胁迫下的表达都受到了不同程度的诱导，试验结果证明了WRKY转录因子在茶树抗逆方面有重要作用。1.4实验流程简述本课题是研究喜树WRKY转录因子的克隆，目前为止，已经有许多学者成功在其他植物例如铁皮石斛、茶树、丹参等中克隆得到WRKY转录因子，并对其进行了生物学信息分析，WRKY转录因子在植物应答生物和非生物胁迫中具有极其重要的作用，但对于喜树WRKY转录因子克隆及其表达分析的研究尚不明确，但在前面学者研究的基础上，喜树WRKY转录因子克隆的研究会逐步走上正轨。本实验利用新鲜的喜树嫩叶，提取喜树总RNA，反转录得到cDNA，设计引物，PCR扩增目的片段，加A连接T载体，转入大肠杆菌感受态培养，蓝白斑筛选，扩大培养，提取质粒。1.4.1实验流程图 第二章材料和方法2.1实验材料、试剂以及仪器2.1.1实验材料材料：喜树嫩叶质粒：pGM-T载体菌株：大肠杆菌图2.1.1.1喜树植株实验室种植的喜树，生长温度控制在22℃-25℃之间，放置于窗边有光区，栽培的土质或介质较为松散，土壤（介质）的pH控制在5.8-6.2范围内，以提供喜树最适宜的生长条件。2.1.2实验试剂和酶表2.1.2实验试剂、酶2.1.3实验仪器表2.1.3实验仪器2.1.4实验体系和培养基1%琼脂糖凝胶配方表2.1.4.11%琼脂糖凝胶配方序号药品含量①琼脂糖0.3g②1×TAE30mL③EB5µL反转录体系（20µL）表2.1.4.2反转录体系（20µL）序号药品含量①RNA11µL②Oligo(dT)182µL③dNTP2µL④⑤5×ESRTBuffer反转录酶4µL1µL加A反应体系表2.1.4.3加A反应体系（10μL）序号药品含量①胶回收产物6μL②10×TaqBuffer2μL③dNTP1μL④Ex-Taq酶1μLpGM-T载体连接体系表2.1.4.4pGM-T载体连接体系（10μL）序号药品含量①A-tailing产物7.5μL②T4DNALigase1μL③T4Buffer1μL④pGM-Tvetor0.5μLLB培养基表2.1.4.5LB培养基序号药品含量①胰蛋白胨10g②酵母提取物5g③NaCl5g④琼脂1.8g/100ml备注：调整培养基pH=7酶切体系表2.1.4.6酶切体系（20μL）序号药品含量①质粒2μL②Buffer2μL③XbaⅠ0.5μL④KpnⅠ0.5μL⑤ddH2O15μLPCR扩增体系（30μL）表2.1.4.2FastPfu高保真酶扩增体系（30μL）序号药品含量①FastPfuBuffer6μL②dNTP1μL③引物11.5μL④引物21.5μL⑤模板1μL⑥水19μL⑦Taq酶0.2μLBufferP1表2.1.4.8BufferP1序号药品含量①Tris-HCl（pH8.0）25mM②Glucose50mM③EDTA10mMBufferP2表2.1.4.9BufferP2序号药品含量①NaOH250mM②SDS1％（W/V）BufferP3表2.1.4.10BufferP3序号药品含量①CH3COOK3M②CH3COOH5M蓝白斑筛选培养基表2.1.4.11蓝白斑筛选培养基序号药品含量①酵母浸粉5g/L②蛋白胨10g/L③琼脂粉20g/L④NaCl10g/L⑤IPTG24mg/ml（100mM）⑥X-Gal20mg/mL⑦Amp100mg/mL2.2实验方法2.2.1前期操作准备及说明2.2.1.1目的基因目的基因的确定：图2.2.1.1.1喜树WRKY10目的基因片段图2.2.1.1.2喜树WRKY42目的基因片段2.2.1.2设计引物根据已获得的目的基因WRKY的序列，使用Primerpremier5.0软件，为WRKY基因设计特异性引物，并筛选引物。表2.2.1.2引物引物名称引物序列CaWRKY10-F545'TTCCTGGGTTATCCTTCAAG3'CaWRKY10-R8195'AGATAGCGATGGCTGATTGA3'CaWRKY10-FL-F-Xba15'GCTCTAGAATGCTTAACCAGGGCTTGTT3'CaWRKY10-FL-R-Kpn15'GCGGTACCCTACCAGAAGAAATTATTGA3'CaWRKY42-F665'GATTTGGTCACCAGTCGTATTC3'CaWRKY42-R16205'TGTAAAGATAGCGTTTGGCC3'CaWRKY42-FL-F-Xba1 5'GCTCTAGAATGGACAACAGAGGAAGAGG3'CaWRKY42-FL-R-Kpn15'GCGGTACCTCAATTCCCTGCAAAATTTG3'2.2.2克隆目的基因2.2.2.1喜树总RNA的提取1、目的：利用喜树总RNA反转录得到cDNA，为PCR扩增目的片段提供模版。2、材料：新鲜的喜树嫩叶、重蒸酚、异丙醇、NaAc、水饱和酚、氯仿、PVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮）、75%乙醇、DEPC水（焦碳酸二乙酯处理过并经过高温高压灭菌的纯水）。3、操作（注：在无菌操作台中操作，戴口罩、手套）：准备工作：酒精脱脂棉擦拭试验台2遍，灭菌20min，吹风10min。重蒸酚85℃水浴，3mol\LNaAc85℃水浴，开启冷冻离心机。初提：取喜树新鲜嫩叶，在液氮中充分研磨，研磨速度要快，时间控制在1min以内最佳，研磨完成后分装至离心管内。向离心管内加入1.2ml重蒸酚，15µLNaAc,手摇5min后放入TGL-16台式高速冷冻离心机中离心，4℃，13000rpm/min,30min。除酚、蛋白：将离心管中的上清吸取至新的离心管中，加入500µL氯仿，手摇5min后放入TGL-16台式高速冷冻离心机中离心，13000rpm/min,4℃，20min。取上清至新的离心管中，加入500µL水饱和酚，15µLNaAc，手摇5min后放入离心机离心:13000rpm/min,4℃，20min。再次取上清至新的离心管中，加入500µL氯仿，手摇5min后放入离心机中离心，13000rpm/min,4℃，20min。重复上一步操作取上清至新的离心管中，加入500µLPVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮），轻轻弹匀后放入离心机离心：13000rpm/min,4℃，10min。沉淀核酸：取上清于新离心管内，加入0.7倍体积异丙醇，上下轻轻晃动混匀，放入离心机离心：13000rpm/min,4℃，30min。除盐：吸去上清(注意：不要吸走沉淀)，加入75%乙醇1ml,将沉淀弹起，放入离心机离心：13000rpm/min,4℃，15min。重复上一步骤去掉上清，将沉淀放入LNG-T98A冷冻浓缩离心干燥器中真空干燥1min，待旋干后取出离心管，在离心管中加入30µLDEPC水。4、RNA完整度检测配制1%琼脂糖凝胶，将胶盘冲洗一遍后插好，倒入溶液，等待胶体凝固，凝固后放入电泳槽内，用20µL移液枪吸取5µLRNA加入胶孔中，然后插上电源跑胶，观察跑胶情况。2.2.2.2获取目的片段、连接T载体1、目的：通过反转录技术，我们能够将喜树的RNA反转录得到cDNA，以该cDNA为模版，设计正反引物，进行PCR，进而获取目的片段。连接T载体是为了高效克隆PCR产物，以得到大量我们需要的目的基因。2、材料：RNA、Oligo（dT）18、pGM-T、dNTP、反转录酶（ReverseTranscriptase）、5×ESRTBuffer、ddH2O、3、方法反转录：取完整度检测后的RNA，选取杂质较少的为原料，取11µLRNA、2µLOligo(dT)18、2µLdNTP放入0.5ml的微量离心管中，共计15µL反转录体系进行PCR。设定PCR程序：70°C，5min；放置于冰上2min。该程序结束后向离心管内加入5×ESRTBuffer4µL、反转录酶1µL，得到20µL的体系。将离心管放入PCR仪器，设定PCR程序：42°C60min95°C5min4°C保温待该程序结束后取出离心管，向管内加入30µLddH2O。琼脂糖凝胶电泳：配制1%琼脂糖凝胶，溶液凝固后放入电泳槽，移液枪吸取PCR产物加入到胶孔中进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像系统观察条带，回收目的基因WRKY条带。胶回收：将目的条带从胶块上切下来（注意：尽量切薄一些），放入2mlEP管中，加入400µL的溶胶buffer，弹匀溶解胶体，放入离心机离心使胶体彻底溶解，离心后转移至套管中，缓慢离心6min。快速离心1min，将离心液重新加回套管之中，再缓慢离心3min。快速离心1min，将离心液倒掉，在套管中加入600µLwashingbuffer，再缓慢离心3min。快速离心1min，倒掉离心液，在放入离心机离心，13000rpm，3min，取1.5ml离心管，将套管放在离心管中开盖静置3-5分钟使酒精挥发掉。在套管的膜上加40µL水，静置10min，离心：13000rpm，3min。连接T载体：将上述回收得到的片段进行加A反应，然后使用T4DNA连接酶将其与pGM-T载体连接。加A反应PCR程序：42°C60min72°C60min65°C10min4°C保温2.2.2.3转化、扩大培养1、目的：连接产物质粒转入大肠杆菌感受态菌株后进行蓝白斑筛选试验，得到成功转化的菌株（阳性克隆）。2、材料：感受态大肠杆菌、LB培养基、Amp抗生素、DMSO(二甲基亚砜)3、方法：转化（慢转）：准备工作：打开制冰机，水浴锅（42℃），三角耙用酒精灯火焰灭菌放置冷却。在-80℃冰箱中取出实验室储存的感受态大肠杆菌置于冰上至全部融化，取EP管，在EP管内加入连接产物和融化后的感受态大肠杆菌100µL，轻轻弹匀混合物后置于冰上10min。水浴42℃，30S，放置于冰上10min。加纯LB培养基700µL，放入37℃摇床，1h。在小离心机上离心1min，吸去上清，留下约100µL培养基，将培养基与沉淀混匀后涂板，放入培养箱，37℃，14～16h。挑取白斑、扩大培养：取6个2ml的EP管，每个加入600µL(LB+Amp)培养基，拿出过夜培养的蓝白斑筛选培养基，用灭过菌的牙签挑取白色单克隆菌落放入EP管中，将EP管放入培养箱震荡培养，210rpm，37℃，4～6h。菌落验证：以培养后的菌液为模版进行PCR，20µLPCR体系：Buffer2µL、dNTP1µL、引物1和引物2各1µL、模版1µL、水14µL、Taq酶1µL。设定PCR程序：94℃2-5min30cycles94℃40s30cycles50℃50s72℃60s4℃保温PCR结束后取产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩大培养：取200µL转化成功的大肠杆菌菌液放入50ml的氨苄LB液体培养基,摇床培养，37℃，12h。剩余菌液加入1\10DMSO(二甲基亚砜)防污染，冷冻保存。2.2.2.4提质粒1、目的：获取大量目的基因WRKY2、材料：BufferP1、BufferP2、BufferP3、异丙醇、75%乙醇、100%乙醇、灭过菌的超纯水、RNA酶、饱和酚溶液、氯仿、醋酸钠。3、操作：悬浮菌体：取50ml离心管，将扩大培养后的菌液倒入离心管（低于离心管容量2\3），放入离心机离心，5000rpm，5min。离心完后倒掉上清，收集沉淀。在沉淀中加入3mlBufferP1，震荡使菌体悬浮直至没有沉淀，然后静置5min。碱法抽提：在上述处理过后的菌液中加入3mlBufferP2，上下小频率混匀（BufferP2使得细胞破碎，生物大分子变性），常温静置5min。复合沉淀：在菌液中加入3mlBufferP3（需提前85℃水浴加热），上下轻摇匀，放在冰上20min。而后菌液放入离心机离心，11000rpm，4℃，20min。离心后用滤纸过滤，取新的离心管收集上清。上清中为质粒和RNA。沉淀DNA、RNA：在上述步骤得到的上清中加入上清体积70%的异丙醇(约5ml)。然后放入离心机离心，11000rpm，4℃，30min。离心后倒掉上清，向离心管内加入1ml75%乙醇（除盐），用枪头吹打混匀后再次离心，13000rpm，4℃，5min。倒掉上清，重复一次除盐离心操作。离心完后拿枪吸去上清，沉淀进行真空干燥。除RNA：向沉淀中加入500µL灭过菌的超纯水，轻轻弹匀使沉淀溶解，加入2µLRNA酶，轻轻混匀后进行酶切，烘箱37℃，40min。除蛋白：从烘箱中取出酶切后的离心管，向内快速加入500µL饱和酚溶液，手摇5min(盖紧离心管盖，防止液体溅出)。离心13000rpm，5min。饱和酚溶液能够溶解残余的蛋白使质粒纯化。收集上清于新的2ml中，加入500µL氯仿，手摇5min，离心13000rpm，5min，重复一次。氯仿用来除去残余的饱和酚。除其他可溶物：取上述溶液的上清于新的2ml离心管中，加入1\10体积，3mol\L，pH5.2的醋酸钠溶液（提前85℃水浴），大约为40µL左右，再加入2倍体积的100%乙醇（大约800µL），轻轻摇离心管直至摇出絮状物，然后离心，13000rpm，5min。离心后除去上清，加入1ml75%乙醇，将管底的沉淀物弹起，离心13000rpm，5min，重复上一步，最后去上清留沉淀真空干燥，加入30～50µL的ddH2O。2.2.2.4酶切检测、回收目的片段1、目的：鉴定目的基因片段是否与pGM-T载体连接成功，若成功连接回收目的片段。2、材料：XbaⅠ、KpnⅠ、buffer、水、溶胶buffer、washingbuffer、琼脂糖、1×TAE、EB、3、操作：双酶切：将上述获得的质粒与pBI121GD载体双酶切，37℃，3h。目的基因鉴定：使用琼脂糖凝胶电泳法对获得的目的基因进行鉴定，配制1%琼脂糖凝胶，插好胶槽，将溶液倒入胶槽等待凝固，凝固后放入电泳槽，将Maker和目的片段分别注入胶孔，插上电源进行跑胶，观察对比条带。胶回收：将连接正确的质粒从胶块上切下来，放入2mlEP管中，具体操作同2.2.2.2中的胶回收方法。提质粒获得WRKY基因，步骤方法如同2.2.2.3送测序

第三章结果与分析3.1喜树RNA完整度的检验采用琼脂糖凝胶电泳法对喜树RNA完整度进行检验，这是最常用的评价RNA是否完整的试验方法，完整的RNA在电泳时会显示两个清晰的条带，28S和18S，同时28S条带的强度会明显的大于18S的条带，大约为18S的两倍，如果RNA不完整，部分降解，条带会出现弥散的情况。123412345S18S28S5S18S28S图3.1.1RNA完整度检验实验结果如图3.1.1所示，可以看到3号泳道有三条明显的条带，分别为28S、18S、5S，条带区分明显且28S条带强度明显大于18S条带，且条带不弥散，说明RNA是完整的，其他三条都出现了不同程度的弥散情况，说明RNA被部分降解，试验结果证明喜树RNA提取成功。3.2大肠杆菌转化将质粒加入融化后的感受态大肠杆菌中，加入LB培养基700µL，37℃摇床1h后离心，吸去上清留下100µL培养基和沉淀，吹打均匀后涂布在蓝白斑筛选培养基上。3.3蓝白斑筛选将以转化的大肠杆菌涂布在蓝白斑筛选培养基上，37℃恒温培养14-16h。图3.3.1蓝白斑筛选培养基可以观察到培养基上有蓝色和白色的菌落不规则分布，大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶将无色底物X-gal降解为半乳糖和蓝色物质5-溴-4-靛蓝，菌株呈蓝色而插入外源基因的大肠杆菌无法产生β-半乳糖苷酶，进而无法对底物X-gal分解，菌株呈原本的白色。挑取转化成功的白色菌落进行下一步试验。3.4菌落验证蓝白斑筛选得到的白色菌落还需进一步检验是否包含转化成功的菌种，通过PCR使得菌体热解暴露DNA，再通过琼脂糖凝胶电泳，观察条带，是否有成功连接T载体的重组质粒。3.4.1WRKY10转录因子2000bp1000bp750bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3.4.1.1pGM-T-WRKY10大肠杆菌菌落鉴定在试验结果图3.4.1.1，我们可以看到明显的DNA条带，对比maker，我们得到的片段大小为700bp，可证明该条带为目的基因WRKY10的条带，实验证明T载体连接成功。3.4.2WRKY42转录因子5000bp5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp

5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp在试验结果图3.4.1.2，我们可以看到明显的DNA条带，对比maker，我们得到的片段大小为1400bp，可证明该条带为目的基因WRKY42的条带，实验证明T载体连接成功。3.5酶切检测通过双酶切法将质粒与pBI121GD载体酶切，从而获取得到目的基因，验证质粒是否构建成功。3.5.1WRKY10转录因子质粒空载体目的基因WRKY10(700bp)2000bp1500bp质粒空载体目的基因WRKY10(700bp)2000bp1500bp750bp500bp250bp100bp图3.5.1酶切结果如图3.5.1中所示，进行双酶切后电泳显示有三个区分明显的条带，第一条为质粒，第二条为空载体，第三条即为大小700bp的目的基因WRKY10。证明质粒构建成功。3.5.2WRKY42转录因子Maker12Maker12质粒空载体目的基因WRKY42(1400bp质粒空载体目的基因WRKY42(1400bp)5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp图3.5.1酶切结果将实验得到的两组重组子进行双酶切，如图3.5.1中所示，进行双酶切后电泳显示有三个区分明显的条带，第一条为质粒，第二条为空载体，第三条即为大小1400bp的目的基因WRKY42。证明质粒构建成功。3.5试验分析与讨论喜树WRKY转录因子的克隆对于喜树培育、WRKY基因的研究具有一定的意义，本实验以喜树为研究载体，WRKY转录因子为研究对象，对喜树WRKY转录因子进行克隆，通过提取喜树总RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模版PCR扩增目的条带，与T载体连接转入感受态大肠杆菌，通过蓝白斑筛选、菌落PCR鉴定、双酶切验证，最终得到大小700bp的WRKY10和1400bp的WRKY42转录因子。结论WRKY转录因子在植物面对生物和非生物胁迫中具有极其重要的作用，本实验采用基因工程的方法对喜树WRKY转录因子进行克隆，实验使用新鲜的喜树叶片提取得到喜树RNA，在喜树RNA完整的检验实验中，出现了清晰的28S和18S的条带，说明提取到的RNA是完整的，可以进行下一步的反转录。喜树RNA反转录得到cDNA，设计正反引物，以cDNA为模版，PCR扩增目的片段，回收目的条带加A连接T载体以获得更多我们需要的目的片段。连接产物转入感受态大肠杆菌进行培养。蓝白斑筛选试验中出现了白色菌落，β-半乳糖苷酶无法表达，外源片段成功插入，证明了连接体成功转入到大肠杆菌内。菌种鉴定实验对白色菌落进行了进一步的检验，旨在验证挑取的白色菌落是否有目的片段与pGM-T载体连接成功的重组质粒（pGM-T-WRKY），实验结果分别得到了与WRKY10和WRKY42基因大小一致的条带，证明pGM-T载体连接成功。酶切检测得到大小为700bp的WRKY10和1400bp的WRKY42基因。综上所述，本实验成功在喜树中克隆得到了WRKY10转录因子以及WRKY42转录因子，大小分别为1000bp和1400bp。对于喜树WRKY转录因子的研究仅仅走出了第一步，对于喜树WRKY转录因子的研究需要更深一步的实验，WRKY转录因子在喜树中的表达分析研究，生物学信息的探索等等，喜树和WRKY转录因子的神秘面纱将一步一步的被揭开。参考文献[1]谢政文，王连军，陈锦洋，等.植物WRKY转录因子及其生物学功能研究进展[J].中国农业科技导报，2016，18(3):46-54.[2]toleranceintransgenicNicotianabenthamiana[J].PLoSOne，2015，10(11):e0143022.[3]HanM，KimCY，LeeJ，etal.OsWRKY42repressesOs-MT1dandinducesreactiveoxygenspeciesandleafse-nescenceinrice[J].MoleculesandCells，2014，37(7):532-539.[4]ZhouX，JiangY，YuD.WRKY22transcriptionfactormediatesdark-inducedleafsenescenceinArabidopsis[J].MoleculesandCells，2011，31(4):303-313.[5]BesseauS，LiJ，PalvaET.WRKY54andWRKY70co-operateasnegativeregulatorsofleafsenescenceinAra-bidopsisthaliana[J].JournalofExperimentalBotany，2012，63(7):2667-2679.[6]JiangJ，MaS，YeN，etal.WRKYtranscriptionfactorsinplantresponsestostresses[J].JournalofIntegrativePlantBiology，2017，59(2):86-101.[7]RushtonPJ，SomsichIE，RinglerP，etal.WRKYtranscriptionfactors[J].TrendsinPlantScience，2010，15:247-258.[8]于延冲，乔孟，刘振华，等.WRKY转录因子功能的多样化[J].生命科学,2010,22(4).[9]王娜，张振葆，黄凤珠，等.WRKY转录因子参与植物非生物胁迫应答的研究进展[J].核农学报，2014，28(10):1819-1827.[10]张全琪，倪燕妹，朱家红，等.巴西橡胶树HbWRKY1基因的克隆及转化烟草的初步研究[J].热带亚热带植物学报，2012，20(4):356-364.[11]李蕾,谢丙炎,戴小枫,等.WRKY转录因子及其在植物防御反应中的作用[J].分子植物育种,2005,3(3):401-408.[12]PhukanUJ，JeenaGS，ShuklaRK.WRKYtranscriptionfactors:molecularregulationandstressresponsesinplants[J].FrontiersinPlantScience，2016，7:760.[13]颜君,郭兴启,曹学成.WRKY转录因子的基因组水平研究现状[J].生物技术通报,2015,31(11):9-17.[14]余迪求，陈利钢，张利平.转录调控因子WRKY超级家族:起源,结构和功能[J].云南植物研究，2006,28(1):69-77.[15]蒋园，朱玉球，高燕会，等.铁皮石斛WRKY5基因的克隆与表达分析[A].中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第47卷第2期2016年1月:301.[16]冉昆,王少敏,魏树伟,等.植物非生物胁迫相关的WRKY转录因子研究进展[J].青岛农业大学学报,2014,31(3):217-224.[17]王瑶瑶,丁剑兰,韩卓,等.喜树碱关键酶基因的克隆与生物信息学分析[A].现代农业科技，2019，第2期.[18]仇玉萍，荆邵娟，付坚，等.13个水稻WRKY基因的克隆及其表达谱分析[J].科学通报，2004，49(18):1860-1869.[19]王鹏杰，陈笛，林邑，等.8个茶树WRKY转录因子基因的克隆与表达分析[A].中草药ChineseTradit