分子生物学实验

分子生物学根底试验分子生物学试验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不行缺少的一局部。为提高学生在分子生物学技术方面的动手力量，生物技术综合试验室主要开设常用而根本的分子生物学试验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。试验一质粒DNA的小量制备一、试验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。载体的设计和应用是A:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制生殖〕载体A链上有1〕载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因，抗霉素基因〕等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可依据这个标记将受体细胞从其他细胞中分别筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒〔plasmid〕1～120kb之间，具有双链闭合环状构造的DNA分子，主要觉察于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录力量，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它掌握的很多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制〔stringentcontrol〕〔relaxed120个以上。通常大的质粒如FColEⅠ质粒〔含有产生大肠杆菌素1基因DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒连续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNADNA的含量由原来的240％－50％。本试验分别提纯化的质粒pBR322、pUC19ColEⅠ衍生的质粒。全局部别质粒DNA:培育细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分别和纯化质粒DNA。承受溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠〔SDS〕可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂〔SDS〕处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质DNADNA。DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，pUC191.7×106。在细胞内，共价闭环DNA〔covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA〕常以超螺旋形式存在。假设两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋nr，简称。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本试验中，自制DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、试验目的把握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。了解制备原理及各种试剂的作用。三、试验材料和试剂材料：大肠杆菌E.col，含2质粒。试剂：LB培育基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaClNaOHpH7.3左右。如固体培育基则添加15g/L琼脂。溶液ⅠT缓冲液0LlL。灭菌后存放。溶液Ⅱ〔内含1％)：预先配制1％S母液，临用前一天晚上参加0.2mol/LNaOH，4℃保存。溶液Ⅲ8乙酸钾溶液L乙酸钾、冰乙酸、双蒸馏水。酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中参加异戊醇，使其体积比24:1，然后等量的参加重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色1℃保存。无水乙醇7.70％乙醇8.pH8.0TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl1mmol/LEDTA，其中含RNA20μg/mL。仪器：恒温培育箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。四、操作步骤〔一〕培育细菌将带有质粒2的大肠杆菌接种在含L的B液体培育基中℃振荡培育过夜。留意：添加Amp时，须待LB培育基冷却到50℃左右方可参加。〔二〕从菌落中快速提取制备质粒DNA1.4mL菌液置于1.5mLEp管中，15000rpm3min。弃上清，参加150μL GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放10min。200μL0.2mol/LNaOH(1％SDS)，加盖，颠倒〔不要振荡〕2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。参加150μL15min。5．4℃，10000rpm5min，上清液吸至另一干净的1.5mLEp中，如上清液浑浊则需重离心一次。/氯仿液，振荡混匀，4℃，12000rpm离心2min，留神吸取上清液，转移1.5mLEp管中，留意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。向上清液参加2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使全部液体流出。用0.5mL70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm3min(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。25uLDNARNase(20ug／mL)TE重溶解DNA，置于4℃保存，供下午电泳使用。贮存于-20℃备用，可长期保存。五、留意事项收集菌体提质粒前，培育基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合肯定要严峻，承受上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上猛烈振荡。其中参加溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；参加溶液Ⅲ后，消灭絮状沉淀。苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严峻烧伤及衣物损坏，使用时应留意。如不留神皮肤上遇到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)层溶液，由于上层是Tris-HCl液隔绝空气层。

/氯仿/异戊醇时应取下酚/氯仿//氯仿/色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。试验中，涉及酚/Ep管，全部弃用，不回收。有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过屡次移接有可能造成质粒丧失。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。六、思考题裂解细菌时需留意的事项有哪些？重悬应完全：用枪吹打后应在涡旋振荡器上重悬充分，使得细胞能与液体充分接触发生作用；菌量应适当：应防止细菌过多所造成的裂解不完全；DNA产量下降。质粒的根本性质有哪些？质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用掌握要素结合在一起的复制起始区整个遗传单位定义为复制子。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可打算复制的方式，如滚环复制和θ复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点；质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。质粒的不相容性〔4〕转移性质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到宿主内。两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性及DNA限制系统时消灭的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存〔4〕转移性质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到宿主内。碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？pH8.0G.E.T.缓冲液：葡萄糖 ：使悬浮后的大肠杆菌不会很快地沉积到管子底部，增加溶液的粘度，削减抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA；EDTA-Na2

：可除去细胞壁上的Ca+Mg等二价离子，DNA酶对质粒分子的降解作用；Tris-HCl ：使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。H2O ：溶剂；NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性；SDSDNA和染色体DNA；乙酸钾：能沉淀SDS-蛋白质复合物以及附着其上的染色体DNA；也能使多余的SDS-Na+转变为溶解度更低的SDS-K+而沉淀；并能中和溶液的碱性，使质粒DNA复性；酚/氯仿液：重蒸酚 ：一种猛烈的蛋白质变性剂，能格外有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用；三氯甲烷 带走溶液中与质粒DNA液相溶的少量酚由于酚的存在会干扰A260和A280的比值；有猛烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。异戊醇 ：削减泡沫的生成，以防质粒DNA被打断；Tris-Cl PH；〔7〕70%100%乙醇；〔8〕RnaseA：用于消化质粒DNA溶液中的剩余RNA。抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？细菌培育使质粒大量扩增；收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA；RNA等杂质，分别和纯化质粒DNA。如何提高质粒DNA的产量？适当增加菌量；所用菌不应是长期传代的菌，由于长期传代的菌质粒丧失比较严峻；重悬应充分；裂解液应颖；中和应完全；用乙醇沉淀洗涤时，不用将乙醇吸的太干净，留少量乙醇让其自由挥发。为什么质粒DNA不能反复在4℃、-20℃、室温中放置？为到达这一目的，需要留意些什么？反复冻融的过程中，液固状态的体积会发生变化，对质DNA构造会产生力学作用，导致质粒的不稳定；反复冻融意味着反复操作，会增加引入核酸酶污染的可能性，同样会导致质粒的不稳定。试验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定一、 试验原理测定核酸通常承受两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。紫外分光光度法DNA或RNA260nm280nm260nm1ug/mLDNA钠盐的A0.20，即在A=1DNA50ug/mLDNARNA40ug/mL，单链260寡核苷酸的含量为33ug/mL。双链DNA＝A×50×稀释倍数〔ug/mL〕260RNA＝A×40×稀释倍数〔ug/mL〕260单链DNA＝A×33×稀释倍数〔ug/mL〕260此外还可以依据260nm280nm〔A

/A〕估量核酸的纯度。琼脂糖凝胶电泳法

260

280DNAEBDNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA2－15－10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。由于电泳时所用的样品量格外少，只要将浓度掌握在几十纳克即可，所以在基因工程中常常被用做DNA样品。表2－1 λDNA/HindⅢ中DNA片断片段碱基对数目/kb相对分子质量DNA含量/%DNA含量/(ng/mg)123.13015.0×10647.7476.929.4196.12×10619.4194.136.5574.26×10613.5135.244.3712.84×106989.952.3221.51×1064.847.962.0281.32×1064.241.870.5640.37×1061.111.680.1250.08×1060.32.6二、试验目的从以上试验中提取到的质粒DNADNA的纯度、含量以及分子量大小。DNA、含量与相对分子质量大小。三、试验材料和试剂材料：自制的质粒DNA、λDNA/Hind试剂：1．标准DNAmarker(λDNA/ HindⅢ)2．限制性内切酶EcoRⅠ或HindⅢ和10X缓冲液酶反响中止液：0.25％溴酚蓝(40％蔗糖)，已配好。溴化乙锭染液：使用前稀释0B应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后马上用大量的水冲洗干净。5．0.5×TBE缓冲液：Tris2.18g1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸馏水定容至400mL。可配成5×TBE母液，使用时稀释10倍即可。6．0.7％琼脂糖仪器：37Eppendorf架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管(1.5mL)、加样器(20uL～lmL)、吸头。四、试验操作〔一〕质粒DNA1．提的质粒，在10uL〔BamHⅠ〕进展处理，即：质粒DNA L10×缓冲液 1μLBamHⅠ 1μL2．37℃，保温3-4h。31/10〔二〕琼脂糖凝胶板的制备1．琼脂糖凝胶的制备1.0g100mLTBE1％。2．胶板的制备将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。将有机玻璃内槽放入电泳槽中，参加0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。加样

胶板内的样品小槽用微量加样器将上述样品分别参加胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避开穿插污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽四周的凝胶面，10uL左右。(每块胶板需点一个Marker，这里即为λDNA/HindⅢ)电泳加完样品后应马上通电，进展恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分别DNA片段的最大区分率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝染料〔蓝色〕移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停顿电泳。染色将电泳后的凝胶浸入EBDNA带。染色20min后，用大量水冲洗。观看在波长为254nmDNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。五、留意事项基因工程是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必需严格留意吸样量的正确性，确认样品确实被参加反响体系。酶应在－2020要将酶在冰浴中放置过久，或放在高于0℃以上的环境中，以防止酶失活。3．酶切加样次序为水、缓冲液和DNA，然后混匀。酶永久是最终参加的，如将酶直接参加浓缩的缓冲液中会引起严峻的失水。酶切反响体系的溶液加完后，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底，不要用振荡器。此步操作是整个试验成败的关键，留意防止错加、漏加。4．为了避开穿插污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。5滴洒在台面或地面上，用后用水彻底冲洗干净。六、试验结果第一次质粒电泳 其次次质粒电泳BamHI酶切电泳试验结果分析：1、第一次质粒电泳班级大局部同学都没有条带，分析可能缘由为某个公共步骤消灭问题，进一步探讨得出可能为菌种有问题；2、其次次质粒电泳成功获得质粒条带，但条带亮度较弱，说明质粒A损失较严峻，可能缘由为〕重悬不充分〔2〕裂解不完全〔3〕中和不完全〔4〕用乙醇洗DNA条带有较强的亮度，说明有蛋白质污染；3、BamHI酶切质粒所得到的电泳条带单一、无拖尾、无弥散、亮度较强、点样口四周亮度弱，说明酶切效果较好，无蛋白质污染，也说明质粒上BamHI酶切位点单一。七、思考题EB显色的原理。解：琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进展染色，溴化乙锭含有一个可以DNA积存碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用这个基团的固定位置及其与碱基的亲热接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA254nm302nm366nm的光辐射。这两种状况下，被吸取的能量在可见光谱红橙区的590nm处重放射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭〔0.5ug/ml〕时，可以检测到少至10ng的DNA条带。使用溴化乙锭时应留意什么？BB作环境的通风；操作时，应留意避开衣服或者皮肤接触被EB污染的试验台或者其他工具；操作时所用的手套、枪头、抹布、胶和电泳液等在试验完毕后都应经过严格的处理后才能丢弃。说明不同电压对电泳结果的影响是什么？解：电场强度太大——泳动速度快，易产生拖尾；凝胶的有效分别范围小，不适宜分别大片段；电场强度太小——涌动速度慢，且易产生弥散。如何推断DNA的纯度？〕假设点样孔四周较亮，说明样品蛋白质污染较严峻；假设在质粒DNA下面〔远离点样孔〕有杂带，说明样品中有RNA；假设在质粒DNA1-2条带，说明提取的质粒DNA质量不好，有断片或者开环。试验三感受态细胞的制备及转化一、试验原理DNA分子。转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得的遗传性状的一种手段。转化的根本原理是细胞0℃，CaCl2DNADNase的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞外表，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸取DNA复合物，在选择性培育基平板上培育，可选出所需的转化子。二、试验目的学习和理解影响细胞感受态的因素，把握感受态细胞的制备方法。把握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有遗传性，并从中选择出转化子。三、试验材料和用具材料：自制的质粒DNA、大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。试剂：LB(无抗生素)、LB琼脂平板(50μg/L氨苄青霉素)、LB液体培育基5mL(无抗生素)、LB液体培育基100mL(无抗生素)、LB液体培育基5mL(50μg/L氨苄青霉素)、0.1mol/LCaCl2

溶液(灭菌备用)。仪器：恒温培育箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。四、操作步骤(一)大肠杆菌感受态细胞的制备从活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培育基中，37℃振荡培育过夜，0接种于LB℃快速振荡培育。1.4mL培育液放入离心管中，在冰上放置10min4℃5000rpm10min。将剩余液体尽量去净，重复步骤2。可用加样器将剩余液体尽量去净，用1.2mL0.1mol/LCaCl2

溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min。4℃，5000rpm10min。弃上清，参加200μL0.1mol/LCaCl2

溶液，留神悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。h％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于Ep管中，-70℃条件下可保存半年至一年。(二)细胞转化编号编号质粒感受态细胞无菌水样品12/100100/20.1mol/LCaCl2//取L摇匀后的感受态细胞悬液，进展下一步的转化，转化如下〔：样品组即为我们的转化组：100μL感受态细胞＋2μLDNA1为受体菌比照组：100μL感受态细胞＋2μL无菌水将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温90s，然后快速在冰上冷却3～5min。上述各管中分别参加200μLLB液体培育基，使总体积为500μL，该溶液称为转化反响原液，摇匀后于37℃振荡培育30min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。(三)平板培育75μL分别接种于含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的LB平板培育基上〔分别记为和℃培育，待菌落生长良好且未相互重叠时停顿培育。(四)检出转化体不含抗生素培育基

含抗生素培育基

结果分析受体菌比照组转化试验组

有大量菌落长出有大量菌落长出

无菌落长出有菌落长出

本试验未产生抗药性菌株质粒进入受体菌中产生抗药性五、留意事项这一个试验中的全部操作均要为无菌操作，在超净工作台内进展。细胞转化中，4290s要准确操作。制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的肯定不要在室温中放置。思考题感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？解：细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞会膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞外表〔DNase会消化外源DNA，如形成抗DNase的物质有利外源A的生存，从低温突然提高到cAMPcAMP可转变细胞膜通透性，促使细胞吸取DNA复合物，从而大大提高转化率。思考转化后平板培育应有的结果、分析自己培育的状况。试验所得图片：转化试验组1——含抗生素 转化试验组1——不含抗生素转化试验组2——含抗生素 转化试验组2——不含抗生素受体菌比照组——含抗生素 受体菌比照组——不含抗生素试验结果：转化试验组中含卡拉霉素的培育基有少量的单克隆长出；转化试验组中不含卡拉霉素的培育基有大量菌苔长出；比照组中含卡拉霉素的培育基没有细菌生长；比照组中不含卡拉霉素的培育有大量菌苔生长。试验结果与预期全都。结果分析〕试验组与比照组的区分说明，试验组中含卡拉霉素的培育基上有细菌生长的缘由是细菌摄取了外源质粒，而不是由于原菌液中有能抗卡拉霉素的突变菌株；试验组中含卡拉霉素与不含卡拉霉素的培育基的区分说明感受态的转化效率很低；比照组中含卡拉霉素与不汉卡拉霉素的培育基的区分说明卡拉霉素没有失活。 pH8.0G.E.T.缓冲液(灭菌后使用)：葡萄糖 0.991gEDTA-Na2

0.372gTris-HCl 0.303gHO 100mL25mol/LKAc：49.08g KAc100mLHO。2PH4.8乙酸钾溶液：取60mL5mol/LKAc,11.5mL冰醋酸，28.5mLHO即可。2lg溶于LH。20.2mol/LHCl1.724mLHCl100mL。0Ll取l参加Ll

补HO至100mL即可。pH8.010mmol/LEDTA-Na：3.722gEDTA-Na

H

2O中，用固体NaOH调整其2 2 2pH值，最终定容至100mL。2pH8.0TE10mLpH8.00