猪蓝耳病抗体及猪伪狂犬病抗体ELISA检测方法

目录TOC\o"1-3"\h\u1材料与方法 31.1材料 31.1.1主要试剂 31.1.2主要仪器 31.2发病情况 41.3病理剖检 41.4细菌学检测 41.5血清学检测 41.5.1猪瘟抗体ELISA检测方法 41.5.2猪蓝耳病抗体及猪伪狂犬病抗体ELISA检测方法 51.6病原检测 61.6.1DNA的提取 61.6.2RNA的提取步骤 61.6.3PCR检测 62结果与分析 72.1病理变化 72.2细菌学检测结果 72.3血清学检测结果 72.4病原学检测结果 82.5治疗措施及转归情况 83讨论与分析 9致谢 10参考文献 10摘要本文重点介绍了典型的猪瘟和高致病性蓝耳病混合物诊断和治疗。这是江苏省某大型养猪场，那里的仔猪和保育猪呼吸急促，腹部发红，情绪低落，进食，腹泻，呕吐。从发病到5天内死亡。在死亡之前，根据流行病学调查，临床观察和实验室检查，神经系统症状，呼吸困难和高烧仍然是该疾病的特征，并被诊断为猪瘟和蓝耳病的高致病性。综合治疗和预防措施取得了良好的效果。该混合物为猪瘟和高致病性蓝耳病猪的混合感染提供了一种诊断和治疗方法。关键词：高致病性蓝耳病猪瘟混合感染诊治仔猪随着中国养猪业的飞速发展和畜禽的频繁分布，越来越多的猪疾病和复杂疾病变得越来越难以控制。中国养猪业的健康生产正受到巨大威胁。特别是在零售农场和中小型养猪场的情况下，猪病影响下的生产经济效益已大大受损，大型养猪场也遭受了疾病和压力。蓝耳病通常被称为猪生殖和呼吸综合症。高致病性耳部疾病是由病毒突变引起的急性和难治性传染病。根据杨晓华等人的研究，仔猪的发病率为100％，死亡率超过50％，母猪的流产率超过30％，肥猪也将死去，这造成了仔猪死亡。严重威胁猪的健康。养猪业。PRRSV感染还会诱导猪的免疫抑制，从而降低免疫系统功能。一些突发性因素可能导致继发感染和混合感染，因此猪病的临床症状变得更加复杂，难以诊断和预防。天科分公司认为，中国大多数养猪场都是熟悉的养猪场，给中国养猪业造成了巨大的经济损失。因此，蓝耳病的防治仍是中国的热点。最近的预防和控制。在中国猪病的发生中，在生产过程中防止蓝耳病的发生和传播非常重要。经典猪瘟与高致病性耳部疾病的结合是一种常见的临床现象。中国许多养猪户都感染了这两种病原体，据报道有数十种疾病。据王永波等人。2011年，我们在102个大型养猪场中测试了猪瘟，猪耳病和原始狂犬病，并在31个养猪场中发现了31个养猪场和清耳养猪场。农田占30.4％，而经典猪瘟和耳病占15.44％。结果表明，中国古典猪瘟和耳病也在增加。面对如此严重的情况，快速诊断和准确治疗经典猪瘟和耳部疾病的混合物非常重要，这是中国兽医需要认真研究的方向。本文介绍了江苏省某大型养猪场的诊治过程，为猪瘟及高致病性耳病的大规模综合诊治提供参考资料。1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂猪蓝耳抗体ELISA检测试剂盒，猪伪狂犬病ELISA检测试剂盒，猪瘟抗体检测试剂盒购自IDEXX。Trizol试剂，逆转录酶和Taq酶分别购自Introgen，Promega和TaKaRa。1.1.2主要仪器3K15高速冷冻离心机；7500实时定量PCR仪JS2380A自动凝胶图像分析仪；LDZM立式智能压力蒸汽灭菌器JA2003电子秤；HG101-1电动滚筒空气干燥机；DK-8D电加热室JN303-4电加热培养箱QB296梯度PCR；HYQ-2121A涡旋混合器。1.2发病情况养猪场位于江苏省南京市。目前，病原体周围有450头母猪（危机发生后21天）。泌乳和哺乳的猪呼吸困难，腹部和末端发红，情绪低落，进食困难。腹泻，大多数呕吐的猪在呕吐的5天内死亡。因神经系统症状而死亡，例如高烧，呼吸急促，体重减轻。发病率为30％，死亡率接近55％。怀孕母猪的流产次数已大大增加。出生后60天，出生前30天和20天分别注射了蓝色疫苗，猪瘟疫苗和猪伪狂犬病疫苗。1.3病理剖检选择3只具有典型症状的仔猪进行病理切片并记录结果。1.4细菌学检测根据常规实验室方法收集紫色明胶，肺和腹股沟淋巴结。使用《兽医微生物实验指南》中所述的染色方法检查涂片。（1）涂层：清洁载玻片，在载玻片上滴一滴水，用有效的消毒剂吸收水滴花键的轻微损坏，然后在室温下轻轻覆盖载玻片以自然干燥。（2）染色：草酸铵结晶紫色染色液，约1-2分钟。洗涤：将染料倒入无色的细水中，该细水从载玻片的顶部流出。（3）煤染料：染色1-3分钟后，洗涤绿色液体。（4）脱水：将酒精脱水30秒至1分钟，然后洗涤。（5）单色：用碳酸盐洗涤红色染料10-20秒（6）显微镜检查：样品完全干燥后，先用高低显微镜观察，再用油镜观察。革兰氏阳性菌为紫色，革兰氏阴性菌为红色。1.5血清学检测对于收集的22个血清样品，使用酶免疫吸附测定（ELISA）检测血清抗体，以检测猪的免疫力（PRRS），耳聋（PRRS）和伪狂犬病（PR）。猪瘟抗体的检测方法严格按照美国IDEXX公司的试剂盒手册进行，猪蓝虫抗体和猪大鼠抗体的检测方法严格按照武汉普瑞公司的方法进行，动物生物学试剂盒。1.5.1猪瘟抗体ELISA检测方法（1）清洗液的制备：用去离子水作为清洗液，浓度为1333610。用适当的试剂和试剂盒稀释每个试剂盒和包装中的试剂。（2）样品稀释：将稀释的测试血清样品以1:40的比例混合。（3）样品反应：将预先包装的板放入用于猪瘟和手足口病的抗体检测试剂盒中。每个母板都有两个语音控制孔，一个用于阳性和空白对照组，另一个用于样品测试孔。将阴性对照组，阳性对照组和空白对照组加入阴性对照组。在阳性对照组中，每个样品的稀释度为100μl，并将样品的测试孔加入到每个100μl孔的稀释的血清样品中。在37度下反应30分钟后，将孔中的液体摇动，将板洗涤3次并干燥。（4）添加酶：除了清空对照组的孔外，每孔添加50孔以结合酶。37至30分钟后，将液体从孔中移出。（5）显色反应：向每个孔中加入底部液体A50sL，然后添加并混合底部液体B50sL，并在室温下于37℃在黑暗中混合10分钟，持续10分钟。（6）终止反应：加50ml终止反应。（7）酶标记的结果：空白对照组为0，并且读取酶的450nmod值。（8）结果：第一阴性对照组：阴性对照组为无色或淡黄色，而阳性对照组明显为黄色，表明该试验有效。结果所有平板阴性对照组均为无色，阳性对照组为黄色，所有猪瘟抗体ELISA包装均有效。有效测试孔的ODS值是对应于语音的ODS值的平均值的2.1倍，并且被分类为正。如果语音对比度a的平均值小于0.08，则结果为0.08。1.5.2猪蓝耳病抗体及猪伪狂犬病抗体ELISA检测方法（1）清洁溶液的制备：取出一匙糖精浓缩液，恢复至室温，加热37至10分钟，将溶解的盐摇匀，并用去离子水稀释20倍。稀释每个试剂盒的试剂，并同时标记相应的试剂和试剂盒。（2）样品稀释度：以1:40的稀释度测试血清并以1：4的稀释度用作阳性和阴性对照。（3）样品反应：去除PRRSV和PRV测试样品后2分钟，使用两块带有稀释清洁液（200sl孔）的清洁板，然后在干净的吸收板上干燥。将100sL的稀释样品添加至测试板。在阴性和阳性对照组中均安装了两个孔。每口井为100sL。轻轻按压样品中的孔，以在37摄氏度下孵育30分钟。将溶液摇入平板的孔中，用200sL/孔的清洁溶液缓慢离开平板3分钟，然后在干净的丝锥上轻拍并干燥吸收性片材。（4）添加酶反应：将100升山羊抗猪标准酶抗体放入每个孔中，将温度设置为37摄氏度30分钟，然后洗涤5次。（5）显色反应：向每个孔中加入底部液体A50sL，然后添加底部液体B50sL，并在室温下放置10分钟而不会混合。（6）反应终止：每孔在10分钟内测量50ml终止溶液的结果。（7）酶联试验结果显示空白为0，酶标性腹膜炎的od值为630nm。（8）PRRS结果证实，阳性对照孔的平均OD630值大于或等于1.0，并且阴性对照孔的平均OD630值必须小于0.3。样品的OD630值大于0.42，为正。OD630值在0.38和0.42之间的示例被视为可疑。采样的OD630值小于0.38，该值为负。（9）PR结果确认正极控制孔OD630的测试条件值为0.8，负极控制孔OD630的平均值必须小于0.3。如果样品孔的OD630值大于0.33，则为正。如果样品孔的OD630值小于0.30，则判定为负。OD630值在0.30到0.33之间的样品井被认为是可疑的。1.6病原检测1.6.1DNA的提取从三头猪中收集猪肺，腹股沟淋巴结和脾脏，并与相同的基因混合，然后使用ThaiNettal系列ThaiTai注射柱ANIMALDNAOUT提取试剂盒提取DNA。取阴性样品sl和400sl均匀液体，加入12.5L蛋白酶K和50L10％SDS溶液，混合并在56摄氏度下反应30分钟；在4°C室温下放置10分钟；12000离心10分钟;丢弃加入1000升乙醇的75％，以洗涤1000升乙醇；在4°C下离心7500分钟，静置5分钟；将溶解在污水中的15种沉淀物溶解10分钟，作为PCR扩增的模板。1.6.2RNA的提取步骤将猪的肺，腹股沟淋巴结和脾脏与三只猪的基因混合，然后使用天网沙系列RNA提取试剂盒提取RNA。而已：（1）从阴性对照组中取出200升血清加入1mL曲安西龙-A，并在剧烈摇动后彻底混合。（2）在室温下放置5分钟以完全分离核酸化合物。（3）加入200sl氯仿混合物，用手指提起涡旋壁杂质并冷却5分钟。在4°C到12000r/min下离心10分钟（液体现在分为3层）。（4）取下顶部进行清洁，添加等量的异丙醇，并充分混合。（5）在室温下储存15-20°C或-20°C（过夜）以沉淀RNA。在4°C至12,000r/min的转速下，离心力在10分钟后澄清。（6）将75％的无水乙醇放入1毫升中，并冲洗一次。在4°C和7600-8000r/min下离心5分钟。（7）拆下上部清洁剂，注意不要吸入沉淀物。超级网民干燥旅行15-20分钟。（8）溶于DEPC水（15sL），置于4°C以下。1.6.3PCR检测根据GenBank登录的CSFV，PRRSV-N基因和PRVgE核苷酸序列，由上海英骏生物合成的Primer5.0软件设计的PCR引物，其他PCR参数如表1所示。表1PCR分析引物序列及循环参数基因Genes引物序列Primersequence(5′-3′)片段大小Fragmentsize/bp退火温度Annealinetemperature/℃延生时间（S）循环圈数CyclesCSFVF:5`GTCACAGCACTTAATGTGGTC3` R:5`CACTTACCTATGGGGTAGTGTG3`512566030PRRSVF:AGCAGGATCCATGCCAAGTAACAACGGCAAGCAGR:TAACCTCGAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG372636030PRVgEF:CCCTGGACGCGAACGGCACGATGR:GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA850686035扩增完后1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。2结果与分析2.1病理变化剖宫产的三只失败的猪的主要病理变化是：肺水肿，间质性和出血性肺炎以及心脏积液。肠壁变薄，腹股沟淋巴结在膜下出血，肾脏变灰和浮肿。2.2细菌学检测结果无菌采集3只患病猪的腹水，肝，脾，肺，肾，腹股沟淋巴结和革兰氏染色，并在显微镜下放大400倍。2.3血清学检测结果使用IDEXX抗体测试试剂盒，从雌性和雄性猪以及一组患病猪中收集了三只仔猪，并收集了血清。猪基于猪瘟，猪蓝耳病毒抗体以及猪伪狂犬病GI和GB抗体。测试结果列于表2。表2显示，经典猪瘟的抗体阳性率低至44.4％，经典猪瘟的抗体阳性率为66.7％。猪蓝色病毒抗体疫苗接种的阳性率为100％，但猪抗体的阳性率为0，几乎没有保护作用。猪中野生毒素（GI）抗体的阳性率为100％，疫苗抗体（GB）为100％，表明该猪场未感染猪伪狂犬病病毒。表2血清学检测结果母猪公猪发病仔猪阳性数阳性率阳性数阳性率阳性数阳性率猪瘟抗体8/1844.4%2/2100%2/366.7%猪蓝耳病病毒抗体18/18100%2/2100%0/30猪伪狂犬GI抗体0/1800/200/30猪伪狂犬GB抗体18/18100%2/2100%3/3100%A/B：阳性数/检测数2.4病原学检测结果猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病毒的PCR或RT-PCR结果见图1、图2。图1猪瘟病毒RT-PCR检测结果图2猪蓝耳病病毒RT-PCR检测结果M:marker;1-3:样品;+:阳性对照;—:阴性对照Fig1ElectrophoresisresultsofCSFVRT-PCRproductsM:marker;1-3:samples;+:positivecontrol;-:negativecontrolM:marker;1-3:样品;+:阳性对照;—:阴性对照Fig2ElectrophoresisresultsofPRRSVRT-PCRproductM:marker;1-3:samples;+:positivecontrol;-:negativecontrol2.5治疗措施及转归情况根据猪场的临床症状，并根据剖宫产的病理状况，实验室检查结果和免疫程序，可以确定这种状况是经典猪瘟和耳部感染的混合体，制定以下治疗方案。（1）无害化处理：将猪深挖，在坑坑和地面撒上生石灰，情况严重。（2）隔离消毒：对疾病苗圃进行封闭管理。农场的各个阶段均用1：500的碘化乙烯气雾剂消毒，使用3％的腐蚀性溶液消毒下水道和粪便，并使用3％的腐蚀性气雾剂对农场的外部环境进行消毒。消毒。头7天每两天消毒一次，一周7天后每两天消毒一次，谷仓外的头7天每三天消毒一次，每七天消毒一次。（3）紧急接种脾脏疫苗：具体计划是向所有母猪和公猪注入4块肌肉。向70岁的仔猪注射1.5块肌肉。仔猪两块肌肉70天；自由。猪瘟疫苗已在10天内免疫。（4）活疫苗用于仔猪的紧急免疫。猪瘟疫苗接种后的第一周，对14岁以下的仔猪在14天之内给予一只肌肉，在56日给予56只肌肉。在14天之内两次注射56岁的仔猪。母猪在出生后7天内放弃一次。（5）综合治疗：每吨生姜多糖1000g，多维强化甲毒素1000g，电解150g，电解1000g，电解7天。通过这些措施，两种疫苗都是完全免疫的，疾病得到了控制。3讨论与分析初步诊断出上述发病率，临床症状为典型的猪瘟与高致病性蓝耳病。目前，猪的疾病和混合感染病例多种多样，表现出各种汇率，病原体症状和病理变异性。因此，混合感染的诊断应与流行病学调查，临床诊断和治疗密切相关。实验室的快速检测可以使诊断符合客观现实，为疾病的预防和控制提供科学依据。专家为混合感染病例的诊断和治疗提供正确的治疗方法。治疗经典猪瘟，消除猪的耳部疾病，经典猪瘟主要在饲料和水中传播，使用防腐剂和黄疸多糖改善免疫力并减轻猪的压力。注射液“复合黄疸多糖”注射液混合抗猪瘟高游离血清感染猪瘟和蓝耳病158例，治愈122例，治愈率为70.9％。尽管有其他方法，但综合预防和控制措施不仅在疫苗接种和药物治疗方面，而且在免疫合理性方面都是普遍目标。据刘仁辉等人介绍，高致病性猪耳聋灭活疫苗首次具有免疫力，增强了免疫力，抗体保护率仅为30％-40％。高致病性鲭鱼耐火疫苗或生物疫苗的使用可以提高免疫力，抗体保护率可以达到80％以上，效率大大提高。此外，从养猪场中纯化病原体对于环境健康管理和严格的繁殖管理更为重要。任何反向链接都将导致疾病和生产利润损失。根据国内外报道，科技人员可以使用多种提取方法。王朝军等报道，安全技术不能完全预防产妇疾病，但适合于商业化生猪的生产，可以减少疾病的危害并改善猪的健康。病原体的纯化是大型养猪场最经济的疾病控制方法。主要方法是传播物种，清理一些畜群，检查整个畜群，然后将其清除。在病原体的纯化中已获得良好的结果。中国已经充分研究并应用了猪瘟去污措施。王勤建立了新的猪瘟净化模型。目前，根据中国古典猪瘟的流行，在大型养猪场或某些地区完全有可能净化猪瘟。在提炼病原体的同时，良好的育种管理和环境健康管理也很重要。致谢这次的毕业论文是在我的杨静红老师亲切关怀和悉心指导下完成的。从毕业选题到设计完成，老师给予了我耐心指导与细心关怀，老师有严肃的科学态度，严谨的治学精神和精益求精的工作作风，这些都是我所需要学习的，感谢老师给予了我这样一个学习机会，谢谢!参考文献：1.郭红炳，冯尚连，吕金辉，规模化猪场猪病流行动向及防治对策［J］.浙江农业科学，2016(2)