DB6540-T 022-2023 马红球菌PCR检测方法

ICS

65.020.30CCS

B

416540

DB

6540/T

马红球菌

PCR

检测方法PCR

test

method

for

streptococcus

equi

发布

实施伊犁哈萨克自治州市场监督管理局 发

布DB

6540/T

022— 本文件按照GB/T

《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由昭苏县西域马业有限责任公司提出。本文件由伊犁州畜牧兽医局归口并组织实施。控制与诊断中心、新疆农业职业技术学院、尼勒克县胡吉尔台乡畜牧业发展中心。本文件主要起草人：马玉辉、吕燕、李海、赵红琼、刘璐、余万里、余海、叶斯哈提·胡安、芦文军、蔡鹏、蔡涛、顾伟芳、雷艳、倪艳、江阿拜•居玛德勒汗。DB

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022—

PCR

1 范围本文件规定了马红球菌的检测方法。本文件适用于马匹上呼吸道渗出物（鼻拭子）及粪便（肛拭子）样本中马红球菌的检测。2 规范性引用文件文件。GB/T

分析实验室用水规格和试验方法GB

19489 实验室

生物安全通用要求NY/T

兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。马红球菌 rhodococcus

equi,

R.

属放线菌目、诺卡菌科、红球菌属。该菌是一种革兰阳性兼性胞内寄生球杆菌，耐酸，无孢子，大多无鞭毛。R.

equi可以在肺泡巨噬细胞中存活并复制，导致不同动物物种和人发生肺部和肺外化脓肉芽肿感染。聚合酶链式反应

chain

reaction,

体外酶催化合成特异DNADNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板两条链上相应的一段互补序列退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以4种dNTPs为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。R.

：马红球菌

equi)ChoE：胆固醇氧化酶

VapA：毒力相关脂蛋白

DNA：脱氧核糖核酸

(Desoxyribonucleic

acid)PCR：聚合酶链式反应

chain

dNTP：脱氧核苷酸三磷酸

(Deoxynucleotide

ddH2O：双蒸水

(Double

distilled

bpVapA

569

ChoE

957

DB

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022—Taq：水生栖热菌

aquaticu)5 生物安全措施GB

19489中的有关规定进行。6 诊断方法主要设备、试剂及耗材冰箱、速冷冻离心机、恒温水浴锅、混匀器、高压灭菌器、电子天平、PCR仪、电泳仪、凝胶成像10

μL，

μL，

μL

μL，100

μL，

μL管、一次性使用采样器（拭子）、50%（体积比）甘油、胰酪大豆胨琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤、细菌基因组提取试剂盒、缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭、DNA

ladder、PCR扩增相关试剂（详见附录A）。样本采集、保存6.2.1 样本采集器具采样器具为一次性无菌产品，一套清洁采样工具仅限一个样本使用。存放样本的容器应清洗干净，121

℃

20

min灭菌后使用，或为一次性使用无菌容器。6.2.2 样本采集步骤8

cm～10

，肛门深度约为3

cm～5

cm），轻轻旋转棉拭子不少于3圈，抽出棉拭子，将拭子样品端置于含有1

mL甘油肉汤的无菌2

mL离心管中，室温条件下

h内运送至实验室，2

℃～8

℃条件下3

d内运送至实验室。如样本不能及时送达实验室，应置于-20

℃以下长时间保存。6.2.3 核酸提取30NMNAT鉴别培养基上， ℃30培养48

h，观察菌生长情况。挑取生长成灰黑色粘稠样的单菌落，使用细菌基因组取细菌基因组，置于

℃待检。检测方法6.3.1 引物序列表1表1 引物列表DB

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022—6.3.2 PCR

扩增体系6.3.2.1PCR

μL2×Taq

Master

，

μL；ddH2O，8.5

μL1

μL（0.5

μM）；下游引物，1

μL（

μM）；模板，2

μL。6.3.2.2 PCR

反应程序：94

℃预变性

5

min；94

℃变性

s，55

℃退火

30

s，72

℃延伸

s，个循环；

℃延伸

10

，4

℃保存。

反应循环参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整.6.3.2.3 ATCC

33701

致病性

equi

6939非致病性

equi

标准菌株）。6.3.3 PCR

产物电泳检测用1×TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖（含100

μl/L荧光染料），在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚好没过胶面，将5

μL

PCR产物加入样品孔内，电泳时以DL

Marker

作为参照，5

V/cm电泳约30

；凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。结果判定致病性R.

PCR产物为957

bp及

bp两条条带。6.4.1 PCR

检测试验成立判定DNA

marker957

bp和569

bp大小的两条目标扩增条带；阴性对照电泳道仅出现约

大小的一条目标扩增条带，参见附录B中图，则试验成立。否则，试验不成立。6.4.2 PCR

检测结果判定在6.4.1成立的基础上，判定检测结果：被检样品泳道扩增到约

bp和569

大小的两条目的条带，则判定为致病性R.

核酸阳性，见附录B中图B.2泳道1；被检样品泳道仅扩增到约957

bp大小的R.

B中图泳道2未出现，则判定为R.

equi核酸检测阴性。6.4.3确证试验将提取的细菌基因组DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司及杭州有康生物科技有限公司委托完成基因组16S

rRNA的一代测序，将序列进行拼接比对，比对结果为R.

，则表明检测结果为阳性，该样本中存在R.

equi。废弃物处理和防止污染的措施检验过程中的废弃物，收集后统一高压灭菌处理。DB

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022—

附 录 A（规范性）PCR

诊断用主要试剂溶液配方A.1 TE

缓冲液（pH=8.0)Tris（1

mol/L

pH

） 10

mLEDTA（0.5

mol/L

pH

8.0） 2

mL加水定容至1

L，121

℃高压灭菌15

，4

℃保存即可。A.2 TAE

电泳液（50×）Tris 242.0

g冰乙酸 57.1

mLEDTA（0.5

mol/L

pH

8.0） 100.0

mLddH2O补充至 1.0

L使用时用去离子水稀释至1×的电泳液。A.3 0.01

mol/L

溶液（

7.2

～

pH

7.4）NaCl 8.0

gKCL 0.2

gKH2PO4

gNa2HPO4·12H20

g使用

mL去离子水溶解，调节pH至7.2

~

，加水定容至1

L。

℃高压灭菌15

min，室温保存即可。A.4 1%琼脂糖凝胶称取1.0

g琼脂糖，加入

mL电泳缓冲液加热溶解，加入溴化乙锭溶液至终浓度为1

μg/mL，15

℃～25 ℃冷却至固态，现配现用。A.5 NMNAT

培养基称取培养基

g于1

L双蒸水中，搅拌溶解，高压灭菌20

，冷却至50

~

60

℃。加入配制好的新生霉素，终浓度为25

μg/mL；放线菌酮，终浓度为40

μ；萘啶酸，终浓度为20

μ；亚碲酸钾35

（100

mm4

℃贮存备用。DB

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022—

附 录 B（规范性）马红球菌菌落形态及

PCR

检测电泳图B.1马红球菌菌落形态图NMNAT鉴别培养基30

℃培养48

h，马红球菌菌落形态见图B.1。图B.1

马红球菌菌落形态B.2 样本采集、核酸提取步骤马红球菌检测结果电泳例图见图。说明：M—DL2000

Maker；1—致病性马红球菌（、VapA+）；2—非致病性马红球菌（、VapA-）。图B.2

马红球菌

检测电泳图DB

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022—

附 录 C（资料性）马红球菌基因扩增片段C.1 马红球菌

基因扩增片段（

bp）1

gtcaacaaca

ggtacaagtt

cgcccgcacc61

ggccgcaaga

tcgtgcccaa

cgtgtacgac121

ttcgagtaca

agtcgggcct

cggcggtgag181

gtcatctacg

agacctacct

cgcgcaggcc241

gcggccaccg

tcaccaaggt

cgcgccggcc301

accggcagcg

agcagggcaa

cgtcgtcgcc361

accaaggtcg

gcagcgtcgg

caccagcaag421

ctcctggtct

tgtcgtcgca

agtcggcgag481

ggctggggca

accacatgtg

ggacgccacc541

ggatccaagc

actgggccga

cccgacggca601

ccgatcttcg

agacctacgt

cagcctgtac661

ctggccatca

tcaattcggg

caccggcaag721

gtcgatctca

tcgacatggc

caagaaggtg781

ttcgacaaga

ccgatctgtt

cggcgtgtac841

aagacgtggg

gcgtgctgct

gaacaaggcg901

accgacaact

acgtggtgga

C.2 马红球菌

基因扩增片段（

bp）1

atgaagactc

ccacagccgt

agctgcggct61

gcggctatga

ttgattccgg

tagcagcagt121

gcgattctca

ctgggagcta

tgacagctcg181

acgacttcgt

gagcaagcga

taccgccggg241

c