rs组分对乳酸菌发酵产生广抗菌肽bac-j23的影响

rs组分对乳酸菌发酵产生广抗菌肽bac-j23的影响

抗感菌活性是指在代谢过程中产生的一种具有抗菌活性的蛋白质或茶多酚。它被认为是天然食物制剂和饲料添加剂，具有广阔的开发和应用前景，但低发酵合成能力是限制大规模生产和应用的瓶颈之一。目前对抗菌肽发酵生产的优化研究主要集中在培养基优化、培养环境、发酵方式等方面。前人研究发现,Nisin发酵中最佳的碳源是葡萄糖和蔗糖,乳酸链球菌分泌合成Nisin培养基关键组分为氮源;PO43-对Nisin合成具有刺激效果,Ca2+能明显促进Nisin的活性,但Mn2+对Nisin的合成具有负面影响。本课题组前期从我国传统发酵食品中成功筛选获得一株产广谱抗菌肽Bac-J23的乳酸菌LactobacillusJ23,为了开展该菌株发酵合成抗菌肽Bac-J23的研究,对乳酸杆菌培养专用MRS培养基的组分对Bac-J23合成影响进行了研究,旨在选择一种既适合LactobacillusJ23生长且利于Bac-J23合成的组分相对简单的培养基,为将来从发酵代谢角度对LactobacillusJ23合成广谱抗菌肽Bac-J23进行调控奠定基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇乳酸菌LactobacillusJ23由本实验室分离。1.1.2mnmn-3-苯基液mse蛋白胨10g,肉膏10g,酵母提取物10g,柠檬酸二铵2g,K2HPO42g,葡萄糖20g,乙酸钠5g,MnSO4·4H2O0.25g,吐温801mL,MgSO4·7H2O0.58g,加水至1000mL,调pH值至6.3,121℃灭菌15min。葡萄糖溶解于200mL水中单独灭菌后混合。1.2仪器、设备和颗粒pH计,德国SartoriusAGPB-10;紫外可见分光光度计(上海仪器有限公司);无菌操作台(苏州净化设备有限公司);生化培养箱(广东省医疗器械厂);电子天平(赛多利斯有限公司);电子水浴锅(江苏国华仪器厂);灭菌锅(上海华线核子仪器有限公司);离心机(湖南星科仪器有限公司)。1.3方法1.3.1最佳碳源的确定对葡萄糖、乙酸铵、柠檬酸氢二铵各自组合,以不含上述3种碳源的MRS培养基为对照,研究对LactobacillusJ23发酵合成Bac-J23的影响,分析确定最优碳源及其最佳浓度。1.3.2最佳碳源的确定对MRS中蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏各自组合,以不含上述3种有机氮源的MRS培养基为对照,37℃发酵24h,研究对Bac-J23合成和LactobacillusJ23生长的影响,分析确定最优碳源及其最佳浓度。1.3.3lactabacisj23的发酵合成分别对MRS培养基中其他组分(吐温,MgSO4·7H2O,MnSO4·4H2O),研究其对LactobacillusJ23发酵合成Bac-J23的影响,分析确定最优碳源及其最佳浓度。1.3.4指示菌最佳稀释度采用琼脂扩散法,细菌素活力定义为用对指示菌观察不到抑菌圈出现的最高稀释度,其倒数为细菌素效价值(AU/mL),计算式为AU/mL=2n×(1000/x),x为细菌素加样体积,n为对指示菌显示抑菌圈的孔数;1000为体积换算值。2结果与分析2.1合成bac-j23葡萄糖(A:20g/L)、柠檬酸氢二铵(B:2g/L)、乙酸钠(C:5g/L)为MRS培养基的主要碳源。上述3种碳源及其各自组合对Bac-J23合成的影响结果见图1。结果表明,葡萄糖(20g/L)和柠檬酸氢二铵(2g/L)抑制了Bac-J23的合成;乙酸钠(5g/L)对Bac-J23的合成具有刺激诱导作用,但合成诱导作用方式及机理还有待于进一步深入研究。进一步研究了其他有机碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖)对合成Bac-J23的影响,结果见图2。麦芽糖最有利于菌体生长,而蔗糖最有利于Bac-J23合成;Bac-J23的合成与菌体生长进程表现出不一致性。2.2培养基中主要氮源的确定蛋白胨(A:1%)、酵母提取物(B:0.5%)、牛肉膏(C:1%)、柠檬酸氢二铵(0.2%)为MRS培养基中的主要氮源。研究了上述几种氮源及各自组合对Bac-J23发酵合成和菌体生长的影响。从图3可知,酵母提取物对菌体的生长和Bac-J23的合成均最有利于,而蛋白胨没有明显效果,因此将牛肉膏和酵母提取物作为优选氮源,从而简化了培养基组分。2.3kh2po4对bac-j23的合成影响从图4可知,不同浓度的KH2PO4对Bac-J23合成和菌体生长具有不同的影响。当KH2PO4浓度大于5g/L时,对菌体生长不利;相对而言,KH2PO4(15g/L~20g/L)对Bac-J23的合成更有利,但当KH2PO4高于20g/L时,对菌体生长和Bac-J23的合成均出现负面影响。VUYSTL等研究了KH2PO4对Nisin的合成影响,发现KH2PO4对Nisin合成和菌体生长均有明显的刺激作用。2.4bac-j23发酵条件对bac-j23发酵的影响MgSO4在MRS中的浓度一般为0.58g/L,考察了不同浓度MgSO4对Bac-J23发酵合成和菌体生长的影响。从图5可知,当培养基中MgSO4为0.2g/L时,对Bac-J23的合成最有利,而MgSO4浓度变化对菌体生长的影响不明显。2.5mnso4对bac-j23生长和菌体生长的影响MRS中MnSO4的初始浓度为0.25g/L,研究了不同浓度的MnSO4对Bac-J23合成和菌体生长的影响。从图6可知,MnSO4对Bac-J23合成和菌体生长都没有明显影响。2.6tween-80对bac-j23活性的影响MRS中Tween-80的初始浓度为0.1%,考察了不同浓度的Tween-80对Bac-J23合成和菌体生长的影响。从图7可知,Tween-80对LactobacillusJ23的生长和Bac-J23的合成没有明显影响。当Tween-80的浓度大于0.2%,对Bac-J23抗菌活性有负面影响,这可能是由于Tween-80与合成的Bac-J23结合形成了复合体,导致Bac-J23的活性降低或完全失去活性。液体培养基中Tween-80含量过高不利于Bac-J23的分纯。3氮源中酵母提取物对bac-j23合成的影响研究了MRS培养基各组分对LactobacillusJ23发酵合成广谱抗菌肽Bac-J23的影响。乙酸钠对Bac-J23的合成具有诱导作用,外加有机碳源中蔗糖对Bac-J23合成最有利,氮源中酵母提取物对LactobacillusJ23的生长和Bac-J23的合成均具有明显的促进作用,高浓度的KH2PO4比低浓度的KH2PO4更有利于Bac-J23的合成,MgSO4最适浓度为0.2g/L时,而MnSO4和Tween-80对Ba