我国虫媒病毒研究进展

我国虫媒病毒研究进展

动物疾病是由吸血动物引起的疾病，通过吸收血液、动物疾病传播疾病。其特点是病毒在节肢动物体内繁殖,但是动物自身却不发病。虫媒病毒性疾病大多数是自然疫源性疾病,由于节肢动物叮咬人、畜引起疾病,因此虫媒病毒属于人畜共患病毒。虫媒病毒是近几10年发展较快的一组病毒,1950年全世界只发现35种虫媒病毒,1992年在国际虫媒病毒中心登记的虫媒病毒已经达到535种。其中128种证明对人畜致病。我国到目前已证实4种虫媒病毒在我国的存在与流行,它们是乙型脑炎病毒(JapaneseEncephaitisVirus,JEV)、森林脑炎或春夏季脑炎病毒(Spring-SummerEncephalitisVirus,SSEV)、新疆出血热病毒(XinjiangHaemonhagicFeverVirus,XHFV)、登革热病毒(DengueFeverVirus,DFV)1-4血清型。我国虫媒病毒研究虽然起步晚,但是发展较快。特别是近10年来不但又分离到一些新病毒,而且开始结合血清学和分子生物学对新分离的和原有的病毒进行了系统的鉴定,使我国的虫媒病毒研究工作得到了快速发展。将我国虫媒病毒10年来的研究进展作一综述。1病毒的分离和鉴定自1990年来,我国分别在新疆、海南、山东、烟台等省市分离到多株披膜病毒甲病毒属、呼肠弧病毒科Colti病毒属病毒。另外,对以前分离但未确定的病毒进行了鉴定工作(表1),总结了近10年来分离和鉴定的病毒背景以及其基本生物学特性。1.2Colti病毒属我国近十年来从蚊子中分离了多株Colti病毒,而分离的毒株与欧美流行株之间在核苷酸序列、氨基酸序列存在差异,在流行病学、致病性以及血清学等方面也存在较大差异。由于我国Colti病毒都是从蚊子中分离的,病毒对人的致病性目前并不清楚。2昆虫媒毒症的生物学研究2.1病毒的分离和鉴定病毒全基因组核苷酸序列测定和分析可以阐明已经分离的病毒基因组与病毒标准株、国外流行株之间的基因型差异,从而分析病毒的来源、确定病毒分类及在此基础上进行病毒致病的分子生物学研究,为虫媒病毒性疾病的预防和控制提供理论依据。2.1.1XJ-160毒株是我国首次分离的辛德毕斯病毒,其血清学实验显示,病毒与标准甲病毒的抗体反应阳性,中和试验证实为甲病毒属辛德毕斯病毒。李蕾等对病毒的全基因组核苷酸序列测定与分析显示病毒全基因组全长11626个核苷酸,编码3731个氨基酸。基因组编码四种非结构蛋白和3种结构蛋白和2个小分子肽。核苷酸序列分析表明,XJ-160病毒具备典型的甲病毒属辛德毕斯病毒基因组特征,与标准辛德毕斯病毒(AR339病毒株)相比核苷酸序列存在18%差异,氨基酸差异为8%,提示我国分离株为该类病毒的新亚型。这是我国首次完成的此类病毒的全基因组序列分析。2.1.2YN87448毒株是从云南一位发热病人血清中分离的甲病毒,周国林等对病毒的全基因组核苷序列测定与分析结果显示YN87448毒株结构区基因序列长度为4059个核苷酸,非结构区基因序列长度为7613核苷酸。与辛德毕斯病毒家族中神经毒性最强、唯一能致成年小鼠死亡的S.A.AR86株的核苷酸序列同源性为98.8%,但是YN87448毒株不致成年小鼠死亡。此工作不但明确鉴定了YN87448毒株是辛德毕斯病毒,而且明确了其分类地位,从分子水平揭示了其与病毒标准株的差异。2.1.3XJ-90260毒株血清学鉴定为甲病毒,吕新军等对病毒进行分子生物学鉴定,结果显示病毒基因组3′非编码区核苷酸序列中包含两个重复序列,该重复序列的核苷酸顺序及重复次数具有典型的西方马脑炎病毒的特征。通过序列同源性分析显示XJ-90260病毒株与已知的西方马脑炎病毒株序列同源性都超过93%,系统进化树分析显示与德克萨斯分离株(TBT)和俄罗斯分离株(Y62-33)的进化关系最近。这是西方马脑炎病毒在我国的首次报道。我国9省区的886份血清做流行病学调查显示为该病毒抗体阳性血清24份,阳性率为2.71%。西方马脑炎病毒的分离对我国疾病控制有重要的流行病学意义,因为自从美国9.11事件、炭疽传播事件之后,作为世界公认的生物战剂之一西方马脑炎病毒在我国成功分离将为建立病毒的快速、准确的诊断方法,制备病毒疫苗等工作奠定了基础,为我国制定预防和控制相关的生物恐怖事件的措施提供了参考。2.1.4M-1毒株、HBb17毒株血清学鉴定为甲病毒,赵文忠等将HBb17和M1毒株的3′末端和结构基因的E1区序列的核苷酸序进行测定,结果显示,在3′末端非翻译区HBb17病毒与罗斯河病毒(国际标准株T48病毒)核苷酸同源性为99%,结构基因的E1区序列与罗斯河病毒核苷酸(氨基酸)同源性为99%(99%);M1病毒在3′末端非翻译区与鹭山病毒同源性为98%,结构基因的E1区序列与鹭山病毒核苷酸(氨基酸)同源性为97%(99%),与盖塔病毒同源性为94%(98%)。序列分析表明,海南岛分离的HBb17病毒属于罗斯河病毒,M1病毒可能是鹭山病毒或盖塔病毒的变异株。2.2全基因组核苷酸测序结果及免疫原性改变乙型脑炎病毒引起严重的中枢神经系统疾病,SA14-14-2减毒活疫苗株在我国累计接种1亿人,其安全性和预防效果已得到充分的证实。但是我们也看到一些已经接种疫苗的人仍患病,面对这一现象从毒株的免疫原性上考虑,开展了这一毒株的基因组全序列测定,从核苷酸突变位点上分析减毒机制和免疫原性的改变。全基因组核苷酸序列测定与分析结果显示毒株全基因组全长10976个核苷酸,96到10394为一个长开放读码框,编码3432个氨基酸。突变位点分散于各个区域,7个可能与减毒相关的位点均未发生改变,1296～1506间有4个突变位点,可能作为疫苗质控的遗传学标记。测定这株病毒全基因序列的意义在于可以在此基础上进行基因组结构与疫苗减毒机制的关系研究,同时为疫苗生产的遗传学质控标准的研究奠定基础。2.3全基因序列测定登革热病毒分4个血清型,我国科研工作者对2型登革病毒NS1基因、NS3全基因以及4型登革病毒E基因均做过cDNA克隆和碱基序列的测定和分析。对登革2型病毒(D2-04株)基因组全序列进行了测定,这是我国首次对登革病毒进行的全基因序列测定,结果表明,D2-04株基因组全长10723个核苷酸,同源性比较显示与JAM株类似(97.6%)。之后对登革2型两株病毒(D2-43株、D2-44株)基因组的全序列进行了测定。并对1999年在福建省登革热流行时的病人血清中分离的登革2型一株病毒(FJ-10株)进行基因组全序列测定。结果显示,FJ-1Q株基因组全长10723个核苷酸,有1个开放读码框(OPF,第97-10,269nt),编码3,391个氨基酸,5′和3′非编码区长度分别为96和454个核苷酸。以登革2型病毒E/NS1连接区240个核苷酸序列进行系统发生树分析显示,福建株与印度尼西亚和斯里兰卡分离株亲缘关系较近,同属于第Ⅳ基因型。2.4nsp2基因与诱导细胞凋亡的关系张小青等在描述辛德毕斯病毒诱导BHK-21细胞凋亡的过程基础上将一段病毒非结构蛋白nsP2基因克隆到真核表达载体pMAMneo中,瞬间表达后检测细胞,发现其中一些细胞中出现DNA断裂,这是细胞凋亡的基本指标,从而推测nsP2基因与诱导细胞凋亡相关。李蕾等构建了辛德毕斯病毒(XJ-160病毒株)结构蛋白基因的真核表达质粒,pcDNA3.1ABC,转染BHK-21细胞,观察发现宿主细胞出现细胞毒性反应,表现为:细胞存活率降低;细胞核染色质浓缩、凝集;G1期细胞减少、而处于S期的细胞增多,从而证明完整辛德毕斯病毒结构基因可以引起细胞凋亡。2.5病毒的结构鉴定和pcr检测相对于血清学诊断,分子生物学诊断更加快速、灵敏、检出率和准确性更高。我国在近10年加速了这方面的研究工作,主要的研究进展体现在甲病毒和黄病毒分子生物学鉴定方法的建立。甲病毒基因组分为非结构蛋白区和结构蛋白区。甲病毒在结构蛋白区终止子以后到3′末端多聚腺甘酸尾(polyA)以前为3′UTR,此区间均有40～60个核苷酸的重复序列。但不同的甲病毒3′UTR中重复序列(RSE)的长度、碱基排列顺序、RSE间的距离或RSE距终止密码子的距离以及RSE的类型、数量均各不相同,而相同甲病毒3′UTR中的RSE则比较保守,因此3′UTR可作为甲病毒分子生物学鉴定的依据,我们实验室采用这一方法对分离的XJ-160、YN87448、XJ-90260、XJ-91006、M-1、HBb17等病毒株进行了分子生物学鉴定获得了病毒确切的分类结果。为了早期快速诊断黄病毒感染,方美玉等人在我国建立了黄病毒科病毒的PCR检测方法。首先在黄病毒的NS1基因序列设计了一对通用引物,扩增序列长度是413bp,同时在登革病毒(DEN)1,2,3,4型和乙型脑炎病毒(JEV)设计了各病毒的内引物。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功扩增了DEN1-4型和JEV基因部分片段,并且应用套式PCR的方法对临床诊断为登革热和乙型脑炎患者的血标本进行了检测。结果表明,该方法能直接检测发病患者早期血标本中的病毒基因,并且在2天内完成对黄病毒的鉴别诊断。此方法不但可以检测黄病毒科的病毒,而且还可以特异性地诊断乙脑病毒、登革热病毒,更可贵的是该方法可以对登革热的4个血清型病毒加以区分。上述方法的建立除了在基础科研水平上的意义之外,更重要的意义在于从分子生物学水平证实我国有引起发热、皮疹、脑炎的新病原体的存在,同时也为建立临床上适用的快速、准确的诊断方法提供了基础。3中国昆虫传播疾病的研究3.1离到的虫媒病毒的形态我国地域广阔,地理条件复杂,地跨热、温、寒三带,生物种类繁多,存在着多种虫媒病毒的传播媒介,但是我国目前分离、鉴定的虫媒病毒的种类少,与我国的实情不符。例如布尼亚病毒科的病毒在260种以上,占虫媒病毒总量的一半左右,而我国目前仅发现一种(新疆出血热)。目前分离到的虫媒病毒主要属于披膜病毒科甲病毒属和黄病毒科,今后的工作除了继续在蚊、蜱等常见的媒介分离病毒外,应该加强从稀有的媒介昆虫中分离病毒。例如,白蛉可以传播白蛉热病毒,我国有30种白蛉,很可能存在白蛉热病毒的流行。白蛉热病毒常与黑热病并存,因此应该加强甘肃省、陕西省、新疆等我国黑热病区的白蛉热病毒的研究。近几年我国分离到一些虫媒病毒,少数已经定种,其它的限于各种原因没有确定其分类地位,下一步我们应尽快地对这些病毒加以鉴定。除了未知病毒潜在的危险性之外,一些新分离的虫媒病毒如:辛德毕斯病毒、基孔肯雅病毒、colti病毒、西方马脑炎病毒等,由于分离年代较短,基础研究较差,其人群中致病性还不清楚,同样存在潜在的危险性。其中有首次从发热病人血清中分离的甲病毒属辛德毕斯样病毒(YN-87448),说明此类病毒可能在我国人群中流行。所以应尽快在我国的人群中进行调查,从而证实这些病毒在我国的存在和流行。3.2建设病毒监测系统的必要性虫媒病毒性传染病在历史上曾经严重威胁人类的生命和健康,现在在全世界许多地区仍有多种疾病流行。从我国1991～2001年十年的全国传染病统计资料回顾可见,自然疫源及虫媒传染病死亡率占各种疾病的总死亡率的百分数均稳定在30%～40%。国际形式变幻莫测,像美国遭受的生物恐怖袭击所导致的损失是无法用金钱来衡量的。我国入世之后,国际贸易大量增加,使得许多病毒的传播媒介甚至媒介种群发生移动,通过各种途径进入我国。要防范一些别有用心的人利用病毒制作的生物武器来威胁我们国家,积极的保护我国人民的生命和财产的安全。我国目前正在大力开发西部,将有大量的人群迁入以前偏远的地区,可能会造成虫媒病毒病的传播、甚至爆发流行。因此,需要建立完善的、有效的、切实可行的虫媒病毒和虫媒病毒病的监测系统。具体工作建议如下:(1)系统总结目前已经确定存在和流行的四种虫媒病毒和新分离的虫媒病毒在全国的分布情况,这些病毒相应的媒介在我国的分布情况,具体内容包括病毒的种类、分离到病毒的省份和时间、毒株的特性(基本生物学特性、分子生物学特性)、病毒的传播媒介(长期宿主、扩增宿主)、媒介在分离地的生存背景,建立统计地图加以直观阐明。(2)分析多年的虫媒病毒病的统计资料,找到各种疾病的发病规律,疾病对人群的危害程度,具体内容包括疾病的种类、疾病常发季节、主要发病人群、疾病对人、畜的致死率。同时尽快地研究新分离的虫媒病毒在我国人群中的致病情况。(3)根据不同病毒的情况在全国找若干地区建立监测点,及时掌握每年病毒的变异情况,媒介的数量、疾病的发生情况。将资料上报疾病控制中心以便于全国的疾病监测。3.3性抗体的检测众所周知,一种新的虫媒病毒病的确认,既要分离到病毒,又要获得病毒流行的血清学证实,这需要获得病人急性期和恢复期血清特异性抗体存在4倍以上增长的证据。要获得这些证据只有病毒基础研究单位与医院的通力合作,才能够及时地、准确地收集到病人的脑脊液和/或双份血清。现在我国在临床上有很多不名热、不名脑炎的病例,而这些疾病可能是由虫媒病毒引起的,如果在临床上加以重视,并且及时采集样本送研究单位,将会促进我国