益母草多糖的分离纯化及其抗氧化性研究

益母草多糖的分离纯化及其抗氧化性研究

1益母草的功能糖苷元（ps），也称为多聚糖，是由10多单糖通过糖苷键连接而成的具有广泛生物活性的天然药物。多糖广泛存在于植物、动物和微生物体内,研究证明许多多糖具有提高免疫力、降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗放射、抗衰老、抗过敏等多种生物活性。益母草为唇形科植物益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)的新鲜或干燥地上全草,始载《神农本草经》,列为上品,是常用的中药材。益母草味辛、味苦、性微寒。归心、肝、膀胱经,具有活血调经、利尿消肿、清热解毒之功效。现代医学表明,益母草具有溶栓、抗凝、降脂、降血粘度、降红细胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循环、抗自由基和减少细胞内钙超载等的诸多作用。临床上用于月经不调、产后於痛、心血管疾病、血液病等。益母草中主要化学成分为生物碱类、黄酮类、二萜类、苯丙醇苷类、脂肪酸类、挥发油类、环型多肽、多糖及微量元素等。目前,对益母草中生物碱类、黄酮类的提取工艺较多,而对益母草多糖的提取工艺研究相对较少,对其多糖抗氧化性研究尚未见报道。由此,本文探索了其独特的抗氧化活性作用并对其多糖含量进行初步测定。2实验部分2.1高效液相色谱法益母草干品(购于广西百色市药店);无水乙醇、氯仿、正丁醇、活性炭、硫酸、苯酚、盐酸、邻苯三酚、双氧水、硫酸亚铁、水杨酸等均为分析纯,葡萄糖标准品(批号:234317,纯度99%,北京百灵威科技有限公司)。实验用水为蒸馏水。2.2精密水浴锅设备HC·TP12A-1型架盘药物天平(北京医用天平厂);2085型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);DHG-9070A型电热恒温旋风干燥箱(上海精密设备有限公司);HHS-21-4型电热式恒温水浴锅(箱)(江苏金坛宏凯仪器厂);ZKI-1002型循环水真空抽气泵(上海嘉鹏科技有限公司);RE-52AA型旋转蒸发器(上海安亭实验仪器有限公司);78WH-1型恒温磁力搅拌器(杭州蓝天化验仪器厂);LD4-2A型低速离心机(北京医用离心机厂);722N型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。2.3实验方法2.3.1提取多糖,浓缩多糖称量益母草干品粉末200g置于蒸馏烧瓶中,加水后于室温环境中静置30min,置于恒温水浴锅中,以78℃加热提取,滤渣反复提取2次,每次提取时间分别为3、2h,每次提取液合并,用旋转蒸发仪浓缩至一定体积,加入一定体积的无水乙醇密封,静置一夜,经抽滤后得多糖粗品。2.3.2益母草多酚粗品的提取2.3.2.1.碳脱将多糖粗品置于烧杯中,用一定量水溶解,加入适量活性炭,于78℃水浴锅中搅拌30min后过滤,重复脱色两次,得脱色后的多糖粗品溶液。2.3.2.蛋白质的净化加入相当于前一步骤所得多糖水溶液1/4体积的氯仿,再加入相当于氯仿的1/4体积的正丁醇,将混合物剧烈震荡20—30min,然后以4000r/min离心10min,通过分液漏斗除去水层和溶剂层之间的变性蛋白,如此重复6次,将蛋白质除去。将除去蛋白质的多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏状后,用电热恒温旋风干燥箱烘干,即得多糖样品。2.4采用益母草糖含量测定法2.4.1苯酚溶液的配制(1)准确量取12.5mL苯酚,置于250mL容量瓶中,加水定容,得5.0%的苯酚溶液。(2)准确称量0.08g葡萄糖,加蒸馏水溶解并定容于100mL容量瓶中,得0.8mg/mL的葡萄糖溶液。2.4.2对照品系列溶液的制备准确量取葡萄糖对照标准溶液依次为1、1.5、2、2.5、3mL,分别置于50mL容量瓶中,加水定容,分别稀释成0.016、0.024、0.032、0.040、0.048mg/mL的5个不同浓度的对照品系列溶液。分别准确量取0.5mL样品液5份,置5支具塞试管中,分别加1.00mL苯酚溶液,再加5.00mL浓硫酸溶液,混合均匀后沸水浴加热20min,放冷,用722N型紫外分光光度计,在485nm波长处测其吸光度,以对照品浓度为横坐标,吸光度为纵坐标做校准曲线,建立回归方程,结果见表1和图1。2.4.3回归方程准确称量益母草多糖0.818g置于80mL小烧杯中,加入1mol/LH2SO432mL并使其混合均匀后在沸水浴中加热2h,冷却至室温,将水解液转入100mL容量瓶并加蒸馏水定容,作为储备液。准确量取2mL储备液,置于50mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,按照绘制校准曲线的方法,测其在485nm波长处的吸光度,由回归方程计算益母草多糖水解后其单糖的浓度。校正因子的计算:f=W/CD式中:C——曲线回归方程计算浓度,(mg/mL);D——储备液的稀释倍数;V——多糖样品的溶解体积,mL;W——所取多糖样品质量,mg。经测定f=3.54(n=3)。2.4.4回归方程准确称量益母草多糖0.818g置于80mL小烧杯中,加入1mol/LH2SO432mL并使其混合均匀后在沸水中加热2h,冷却至室温,将水解液转入100mL容量瓶并加水定容,得多糖样品溶液。按照绘制校准曲线的方法,分别测其在485nm波长处的吸光度,由回归方程计算益母草多糖水解后其单糖的浓度,其测定结果如表2。多糖含量%=[(C×D×V×f)/W]×100%式中:C——曲线回归方程计算浓度,(mg/mL);D——样品溶液的稀释倍数;V——多糖样品的溶解体积,mL;f——校正因子;W——所取多糖样品质量,mg。2.5抗氧化性测定：氨基草糖2.5.1脱离主义超氧化基三酚自氧化法(1)邻苯三酚自氧化曲线测定取pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.50mL,加入4.20mL蒸馏水,混匀后在25℃水浴中保温20min,取出后立即加入在25℃水浴中保温过的3mmol/L的邻苯三酚0.30mL(以缓冲液代替邻苯三酚作为空白),混匀后立即倒入比色杯,于特征波长321nm处测定吸光度随时间的变化曲线,得邻苯三酚自氧化曲线。结果如图2所示。(2)邻苯三酚自氧化曲线依上法实验,在加入邻苯三酚前先加入1.00mL的益母草多糖溶液,再加入3.20mL蒸馏水,混合均匀后在25℃水浴中保温20min,取出后立即加入在25℃水浴中保温过的3mmol/L的邻苯三酚0.30mL,混匀后立即倒入比色杯,于特征波长处测定加入益母草多糖样品后邻苯三酚自氧化曲线。其结果如图3、图4和图5所示。根据邻苯三酚自氧化曲线在线性范围内每20s吸光度的增加(用线性回归法求得)即反应速率V,清除率计算如下:清除率(%)=[(V-V0)/V0]×100%式中:V——加入多糖样品溶液后反应速率:V0——不加多糖样品溶液时邻苯三酚自氧化速率。2.5.2清除oh的物质用Fenton反应法产生羟基自由基(·OH)。H2O2/Fe2+体系可通过Fenton反应产生经自由基化学反应如下:H2O2+Fe2+→·OH+OH-—+Fe3+用·OH氧化水杨酸产生有色物质,该产物在510nm处有强吸收峰,若体系中加入清除·OH的物质,则会减少有色物质的生成,吸收度降低。吸光度越低,清除·OH效果越好。测量过程:取5支试管并依次编号,每支试管各加9mmol/LFeSO41.00mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2.00mL,按试管编号各加不同浓度的益母草多糖溶液2.00mL,最后加入8.8mmol/LH2O22.00mL启动反应,在室温下反应1h。并与空白液比较,于510nm处测定其吸光度,便能测定被测物对OH·的清除作用。其结果见表3和图6。其清除率计算式如下清除率(%)=[(A0-As)/A0]×100%式中:A0——空白对照液的吸光度;As——加入提取液后的吸光度。3结果与讨论3.1葡萄糖浓度和吸光度的线性关系根据上表得回归方程由图1可知:A=6.9x+0.0414,R2=0.9993,说明葡萄糖在所取浓度范围内其浓度和吸光度呈良好的线性关系。根据回归方程由多糖含量计算公式和上表可计算得出益母草多糖样品中纯多糖含量为:48.5%。3.2母字草具有净化超氧离阴离子的作用3.2.1变化速度和幅度不同由图2可看出加入多糖样品后邻苯三酚自氧化反应曲线和加入多糖样品前的邻苯三酚反应曲线变化趋势相同,但变化速度和幅度不同。很明显,加入多糖样品后,A321值达到最高值时间均有不同程度的提前,说明益母草多糖样品的加入可加速邻苯三酚自氧化反应的进行,推测其可能由于益母草多糖对O-2·具有清除作用,使反应体系中O-2·浓度减小,从而加速了邻苯三酚自氧化反应的进行。3.2.2清除自由基活性由图3、图4、图5可知各回归曲线的斜率在数值上等于反应速率v,则:0.202%多糖的清除率%=[(v-v0)/v0]×100%=14.3%;0.510%多糖的清除率%=[(v-v0)/v0]×100%=25.0%。从图3、图4、图5可知,益母草不同多糖浓度对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子O-2·具有清除作用,在0.202%多糖浓度时达14.3%,而在0.510%时就达25.0%,随浓度的增加清除率有所提高。3.3益母草多糖对22/fe2+体系的吸附行为根据表3可绘制益母草多糖对清除·OH的清除率变化曲线图。由图6可以看出,不同浓度的益母草多糖对H2O2/Fe2+体系通过Fenton法反应产生的·OH都具有清除作用,且随浓度的增加,清除率升高,即清除率与多糖的用量存在一定的量效关系。在低浓度时,随浓度的增加,清除率明显升高。4益母草多糖的临床应用益母草提取所得多糖样品中纯多糖含量达48.5%,益母草多糖对O-2·和·OH均具有较好的清除作用,而且与多糖浓度成正相关性。大量资料已经证明,炎症