nep1-40基因修饰的神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠行为学恢复的影响

nep1-40基因修饰的神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠行为学恢复的影响

神经干预（iuc）移植是对脊柱损伤最具前景的研究方向，但单纯移植后细胞存活率低，以及局部微环境中nogo蛋白等因素的存在严重限制了新轴突生长。NEP1-40多肽作为Nogo蛋白的拮抗剂能间接促进新生轴突的生长,已成为目前国内外研究的热点,但是单独运用也存在诸多不足。由此,本研究从基因工程角度出发,在体外制备NEP1-40基因修饰的NSC并移植到大鼠脊髓损伤区,观察细胞移植后大鼠行为学功能的恢复情况,以期为NSC移植治疗脊髓损伤提供一种新的思路。1材料和方法1.1动物和主要试剂、仪器1.1.1实验动物及设备清洁级孕18dSprague-Dawley(SD)大鼠1只及成年雌性SD大鼠40只,体质量245~268g,平均250g,由四川大学华西动物实验中心提供(动物许可证号:No.scxk[chuan]2004-14)。本实验过程中对动物的所有处理均符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》之规定。1.1.2培养基和培养方法胎牛血清(上海微科生化试剂公司);重组人表皮生长因子(hEGF)、重组人碱性成纤维细胞生长因子、肝素、神经干细胞基础培养基(NeuroCult®NS-ABasalMedium)、神经干细胞完全培养基(NeuroCult®NS-AProliferationSupplements)、神经小球分散试剂盒(NeuroCult®ChemicalDissociationKitProductDescription)(美国StemCell公司);兔多克隆抗体巢蛋白(Nestin)(美国Proteintechgroup公司),IGO750细胞培养箱(美国ThermoElectronCorporation公司);GX51倒置相差显微镜、BX51TF荧光显微镜(日本Olympus公司),5μL微型注射器(北京英伟达科技公司)。1.2实验方法1.2.1慢病毒转染质粒的构建本研究中我们采用在前期研究中已成功构建的NEP1-40基因慢病毒表达载体。聚合酶链式反应(PCR)产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;蛋白质印迹法显示NEP1-40在293T细胞内稳定表达。1.2.2细胞培养和转染脱颈法处死孕18dSD大鼠后,取出子宫置于预冷的0.1%磷酸盐缓冲液浸泡5min,取出胎鼠并在显微镜下分离出两侧大脑皮层,转移至含预冷NSC完全培养基的培养皿内制成细胞悬液后用200目滤网过滤,静置5min后弃上清液,细胞重悬于NSC完全培养液(基础培养基与扩增添加物混合比例为9︰1),培养基中加入hEGF(20ng/mL)、碱性成纤维细胞生长因子(10ng/mL)、肝素(2μg/mL)、链霉素(100μg/mL)及青霉素(100μg/mL),活细胞计数后按1×106/L的密度接种于75cm2培养瓶中,置于37℃、5%CO2孵育箱培养,每3天半量换液。细胞传代后取第3代细胞进行病毒转染:800r/min离心5min(离心半径15cm)后弃上清液收集神经球,加入神经小球分散剂获取NSC单细胞悬液,按每孔1×105个细胞接种于6孔培养板内,于37℃、5%CO2孵育箱内培养,转染时先按感染复数值=10计算所需加入病毒载体的体积,用计算出的NEP1-40慢病毒载体转染密度为1×107的NSC,轻轻混匀,置于37℃、5%CO2培养箱中过夜培养,24h后重复感染1次。48h后观察荧光表达情况,同时进行反转录(RT)-PCR及蛋白质印迹法检测。1.2.3手术方法及分组40只雌性SD大鼠经切除第8~10胸椎椎板显露硬脊膜:10只在切除椎板后用生理盐水冲洗创面并关闭切口,即假手术组,余30只在第9胸椎水平进行脊髓右侧半切后间断缝合硬膜并关闭切口。术毕放置在40℃恒温加热垫上直至完全苏醒后放回原笼。30只脊髓半切大鼠在手术7d后随机分为3组,每组各10只:脊髓损伤组、神经干细胞移植组(NSC组)和NEP1-40基因修饰神经干细胞移植组(NEP1-40-NSC组)。沿原切口显露受损脊髓节段后采用局部多点注射法,在3组大鼠脊髓损伤部位用微量注射器分别植入5μL细胞培养液、NSC悬液及NEP1-40-NSC悬液(浓度约为1×105个细胞/μL),注射位置在距离损伤处头尾侧各约2mm处,注射速度为0.5μL/min,注射完毕后留针10min,缝合硬脊髓和手术切口。1.3行为测试指标1.3.1运动功能检测又称为开放领域运动测试,是将大鼠置于一个大小约150cm×60cm的平坦椭圆形运动区域,观察大鼠的运动情况4min,根据BBB测试评分表对受检大鼠右后肢的运动功能进行评分,评分范围为0分(后肢全瘫)至21分(后肢完全正常运动)。1.3.2自由行驶的准将大鼠置于一个100cm×38cm的悬空网格状区域(网格开口标准为2cm×2cm),让其自由爬行。为了量化方便,由专人记录大鼠在通过网格时右后肢摔倒(即肢体无法抓住网格而落入网孔中)的次数并对其进行评价,每只大鼠连续测试3次取平均值作为最终测试结果。1.4数据处理及分析所有数据均采用SPSS11.5统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验;检验水准α=0.05。2结果2.1分离和诱导:新冠肺炎细胞中nip1-40基因的转染分离接种的细胞从圆形单细胞逐渐增多汇聚形成大小不一、折光性较好的神经细胞球(图1)。传代培养生成的第3代神经球通过Nestin免疫细胞化学染色后在荧光显微镜下可见神经球Nestin染色呈阳性表达(图2)。转染完成后在荧光显微镜下观察证实NEP1-40已进入NSC内,48h时NEP1-40基因转染的细胞内可见绿色荧光,说明转染成功(图3)。且上述转染后的NSC经分化培养后可见NEP1-40慢病毒基因组及空病毒载体组分化后的神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞中均可见绿色荧光,说明分化后NEP1-40基因可在子代细胞中稳定表达。RT-PCR检测结果表明经转染后的细胞中NEP1-40基因表达明显上调,且与其他对照组有明显差异(P<0.05),用NEP1-40F和绿色荧光蛋白受体引物,扩增片段长度220bp。蛋白质印迹法检测结果显示经转染后的表达产物相对分子质量为32×103,与融合基因的产物NEP1-40与绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白相对分子质量相吻合,证明NEP1-40基因成功转入NSC内(图4)。2.2动物术后右术后撤销术中3只大鼠误伤及左侧半脊髓,2只因麻醉过深导致死亡,术后24h内1只出现严重腹胀而死亡,以上5只均被排除并及时补足。余动物术后约30min恢复清醒,3h开始进饮食,大小便正常。除假手术组外,其余动物术后均出现右后肢瘫痪(图5)。术后第7天细胞移植操作顺利,术后所有动物均恢复清醒和活动,未见明显不良反应,移植术中及术后均无死亡。2.3行为测试2.3.1小鼠骨髓损伤后右下肢功能的恢复脊髓半切术后1周时,所有大鼠右后肢仍处于瘫痪状态,仅少数表现出轻微的恢复(表明啮齿类动物脊髓损伤后有一定的自我修复能力)。至细胞移植后8周时,脊髓损伤组大鼠右后肢功能仅有轻度恢复,肢体内旋状且无法支持体重;NSC组右后肢情况有所改善,呈外旋状但仍然无法支持体重;NEP1-40-NSC组的大鼠则有明显恢复,在行走时右后肢外旋并能部分负重。假手术组大鼠右后肢功能未见任何异常。2.3.2假手术组与假手术组左术后运动完全正常,bcb评分比较所有脊髓半切大鼠术后即刻BBB评分为0分。术后1周时(细胞移植之前),右后肢均无法完成负重行走,呈拖行状态,评分为(0.70±0.65)分,明显低于假手术组(右后肢运动完全正常,BBB评分均为21分),差异有统计学意义(P<0.01)。细胞移植后8周时,脊髓损伤组、NSC组和NEP1-40-NSC组大鼠评分分别为(3.20±0.65)、(8.70±0.95)和(12.00±1.56)分,3组之间两两比较结果差异均有统计学意义(P<0.05),且均明显低于假手术组(右后肢运动完全正常,BBB评分均为21分),差异有统计学意义(P<0.01)。2.3.3术后组和假手术组各时间点倒情况所有脊髓半切大鼠术后即刻网格测试中摔倒次数为(17.20±0.85)次。术后1周时(细胞移植之前)的网格测试中,右后肢仍呈拖行状态,完全无法负重,经常摔入网格孔中,摔倒次数为(15.50±1.96)次,明显高于假手术组(右后肢均未见摔倒,评分均为0分)(P<0.01)差异有统计学意义(P<0.01)。细胞移植后8周时,脊髓损伤组、NSC组和NEP1-40-NSC组大鼠的摔倒次数则分别为(13.30±1.77)、(7.90±0.99)和(4.5±0.85)次,3组之间两两比较结果差异均有统计学意义(P<0.05),且均明显高于假手术组(右后肢均未见摔倒,评分均为0分),差异有统计学意义(P<0.01)。3nogo-66与nop1-40研究发现单纯NSC移植后新生神经元的轴突生长受到明显抑制,这种抑制作用主要有2个来源:一是星形胶质细胞增生形成的胶质瘢痕;二是来源于中枢神经髓鞘的髓磷脂相关抑制物,其中Nogo蛋白的抑制作用最强,且相关研究报道也最多。自2000年Chen等报道克隆出Nogo基因序列以来,深入研究发现Nogo基因共有3个mRNA转录本,其所编码蛋白质分别为Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C,其中Nogo-A相对分子质量最大且发挥主要作用。这3种蛋白质在其碳末端上2个疏水性基团间均存在1个由66个氨基酸残基组成的襻状结构状结构,称作Nogo-66。Nogo蛋白抑制轴突生长的机制主要是由Nogo-66与其下游受体分子信号复合物NgR/P75NTR/Lingo-1(或gR/Troy/Lingo-1)结合,启动了Rho信号传导途径。以Nogo-A为靶点通过使用Nogo抗体和Nogo基因敲除等手段,在动物实验中观察到中枢神经纤维得到良好再生。2007年Su等研究显示Nogo-A加强了移植的嗅鞘细胞在病灶处的相互黏附,阻碍了细胞迁移,从而影响了治疗效果。2010年Hou等发现Nogo-A在增殖中的NSC上表达较强,它除了抑制轴突的出芽式生长外,还能阻碍NSC向神经元分化。由此看来,Nogo基因及相关蛋白在轴突再生抑制过程中发挥了极其重要的作用。2002年GrandPré等首次提出Nogo受体拮抗剂的概念,NEP1-40是针对Nogo-66的氨基序列设计的,其结构与Nogo-66氨基端40个氨基酸残基结构相同,它可与NgR相结合而不激活信号传导通路,因此可竞争性抑制Nogo-66与NgR的结合,从而阻断Nogo-66的抑制效应,NEP1-40逐渐成为促轴突再生研究领域的焦点之一。有学者已应用脊髓损伤和脑损伤动物模型证明NEP1-40能够显著促进皮质脊髓束的再生。Li等将合成的NEP1-40多肽定位注射大鼠脊髓半横断损伤模型,可明显促进损伤轴突的生长及大鼠运动功能的恢复。由此看来NEP1-40作为NgR拮抗剂有望成为脊髓损伤等轴突再生障碍疾病新的治疗手段。然而,目前研究中所使用的NEP1-40都是经人工化学合成,其成本较高,很多学者通过腹腔注射、损伤局部注射等手段将NEP1-40多肽带到中枢神经损伤处来促进轴突的再生,但由于血脑屏障和血脊膜屏障的存在,大于6个氨基酸的多肽一般不易穿过这些屏障,而损伤局部注射法虽然能使NEP1-40直达病灶但是仅有少量多肽能保留活性并最终发挥作用。这些问题都使得NEP1-40多肽的进一步应用受到了极大的限制。基因工程技术的发展较好的克服了单纯NSC移植和NEP1-40多肽应用的局限性。目前已可通过多种手段来获取NEP1-40基因,使其在病灶处完成NEP1-40蛋白的表达,现已在动物实验中用于脊髓损伤等疾患的治疗,国内学者宫福良等通过基因工程手段从大鼠脊髓中获取Nogo-66、NEP1-40基因并实现其蛋白的体外表达。本实验通过基因钓取方法成功的从基因文库中获取NEP1-40基因,然后构建携带该基因的慢病毒载体,通过病毒转染的方法成功将NEP1-40基因导入NSC的基因组中,通过脊髓损伤局部的细胞移植进入到宿主的病灶处,并在宿主体内表达NEP1-40而发挥作用,从而克服了上述局限性。1995年美国Ohio大学研究人员提出了BBB评分法。将大鼠后肢运动分为22个等级,后肢全瘫为0分,完全正常为21分,评估观察时间为4min。BBB评分表是根据观察脊髓损伤大鼠经过3个阶段的恢复而建立的,其与行为学恢复进展是同步的。分值中第1部分:0~7分,评估恢复早期的后肢关节运动;第2部分:8~13分,评估恢复中期的步态和协调运动;第3部分:14~21分评估运动时爪子的精细运动。该方法的优势在于操作简便、可重复性好,其缺点在于评分过程中人为主观因素对分值的影响很大。此外BBB评分系统并不是一个线性系统,量表中每一个评分区域对评估对象均有一定的侧重,这样在评分过程中难免产生一定差距,尤其是14分以上是对于运动细节的评估。在本研究中,除了假手术组大鼠外,其余动物的评分均在14分以下,意味着所有脊髓半切的大鼠的精细运动均无明显恢复,这样就减少了BBB评分系统的缺陷给本研究结果带来的偏差,增加了实验结果的客观性。脊髓损伤后脊髓下行信号通路的运动控制功能出现故障,由皮质脊髓束所介导的前后肢协调运动和步行节律被破坏,那么