异体骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠的临床研究

异体骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠的临床研究

不同的生长条件下，骨髓间充质干细胞（msc）可分为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞，也可分为神经和神经胶体细胞。因此,MSCs用于修复神经系统损伤成为又一热点。异体MSCs是否引发排斥反应,是人们关心的问题。最近发现MSCs具有抑制免疫反应作用,并有在体外行MSCs对T细胞亚群影响的研究,但在体内对T细胞亚群影响的报道较少。我们采用经蛛网膜下腔注射异体MSCs,治疗大鼠脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI),重点研究该方法对T细胞亚群的影响。1材料和方法1.1单克隆抗体低糖DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司,美国),小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体、CD8单克隆抗体(Serotec公司,英国)。Eliteesp型流式细胞仪(Beckman公司,美国),MCO-15AC型CO2孵箱(Sanyo公司,日本),TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂),IX50型倒置相差显微镜(Olympus公司,日本)。1.2细胞传代及分离采用密度梯度离心法进行细胞分离及培养。取6周龄SD大鼠10只,体重100～150g,雌雄不限(四川大学实验动物中心提供)。断颈处死后,无菌条件下取出股骨及胫骨,暴露骨髓腔。7号针穿刺骨髓腔,用含肝素的DMEM液冲洗骨髓至无菌平皿中。将细胞悬液移入离心管,以离心半径22cm,1200r/min离心10min;吸去含有脂肪及血小板的上清液,按2∶1比例加入比重为1.077的淋巴细胞分离液,以离心半径22cm,3000r/min离心30min。离心后管内容物分为三层,在上、中层液体界面处可见乳白色混浊的单核细胞层,吸取该层细胞,移入另一试管中,用L-DMEM稀释,以离心半径22cm,1200r/min离心10min。弃上清,加入含10%胎牛血清的L-DMEM,计数后按2.5×105个/cm2接种。37℃、5%CO2及饱和湿度下孵箱培养,每3天换液。细胞融合80%～90%后传代,传代时采用0.25%胰酶(含0.1%乙二胺四乙酸)消化30s。传至第6代后收集细胞,备用。1.3术后处理及术后防感染方案按文献方法建立SCI动物模型。雌性8周龄SD大鼠60只,体重220～250g(四川大学实验动物中心提供)。动物麻醉后,备皮消毒、俯卧位固定,以T11为中心,于背部取正中切口,显露约3mm×4mm的脊髓打击区,将自制Allen打击架的打击导管紧贴硬膜,垂直对准打击中心,以50g·cm致伤力损伤脊髓。打击时见大鼠双后肢抽动、甩尾,随后完全松弛,明胶海绵覆盖硬膜,逐层缝合切口。术中注意应用肾上腺素及庆大霉素盐水清洗伤口以止血、预防感染。术前及术后3d肌注抗生素,人工定时挤尿。术后7d,大鼠因尿道出血、自残死亡8只。采用BBB后肢功能评分,得分为0者46只,占总数76.7%。随机抽取4只经体感诱发电位、脊髓病理组织切片证实为完全截瘫。1.4实验动物及细胞的制备从BBB后肢功能评分为0的动物中随机取40只,分为实验组(A组)及对照组(B组),每组20只。另取20只体重220～250g的正常雌性8周龄SD大鼠(四川大学实验动物中心提供),作为空白组(C组)。A组:动物麻醉后,后颈部备皮消毒,在枕外隆凸至上颈椎棘突做正中切口,逐层分离至环枕后膜,将预弯的微量注射器针尖以30°角轻刺入环枕后膜约1.5mm,进入蛛网膜下腔,缓慢注入经BrdU(3μg/ml)标记,细胞浓度为2×106/ml的MSCs细胞悬液1ml,注毕用明胶海绵填压,以防细胞悬液外漏,逐层缝合切口。B组:以同样方法经蛛网膜下腔注入等量的L-DMEM。C组:不行任何处理。1.5小鼠血流式细胞仪检测MSCs注入后第1、2和3周,观察各组大鼠一般情况及行BBB后肢功能评分;并经心脏取血1ml,肝素抗凝,行流式细胞仪检测,所用抗体为FITC标记的小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体,RPE标记的小鼠抗大鼠CD8单克隆抗体。第3周时,A、B组大鼠经4%多聚甲醛灌注固定,取损伤处脊髓,行组织切片观察。1.6统计学处理采用SPSS11.0软件包进行统计学分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验,P值<0.05为有统计学意义。2结果2.1组患者治疗前后bbbbbbb/3周bs评分比较A组死亡4只,B组死亡3只,C组无死亡。各组随机取15只纳入实验,于第1、2及3周各取5只检测。A组第3周BBB后肢功能评分优于B组,差异有统计学意义(P<0.05);A、B组在各时间点均低于C组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。2.2cd4+/cd8+t细胞比例ld5A组CD4+T细胞各时间点均较B、C组少,CD8+T细胞第2、3周较B、C组少,CD4+/CD8+T细胞比值第1周较B、C组少,且差异均有统计学意义(P<0.05);但CD4+/CD8+T细胞比值第2、3周与B、C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。A组CD4+T细胞、CD8+T细胞第2周均比第1周减少,但CD4+/CD8+T细胞比值较第1周增加,第3周仅CD8+T细胞较第1周增加,差异均有统计学意义(P<0.05);B组CD8+T细胞第2、3周均较第1周多,CD4+/CD8+T细胞比值第2、3周均较第1周少,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2、图1。2.3社会学观察A组第3周脊髓损伤处空泡缩小,有组织长入,较B组有轻微改善,但未明确见到BrdU阳性标记的MSCs,见图2。3mscs的免疫抑制作用MSCs用于SCI的治疗,是近年来研究的热点之一。将MSCs直接注射到SCI部位效率较高,但存在二次损伤、破坏脊髓内传导束、增加脊髓感染几率等缺点,如有多个病灶,直接注射难以实现。经静脉移植,可避免上述缺点,且在损伤处趋化因子的作用下,MSCs可以透过血-脊髓屏障迁移至病灶,有利于SCI的恢复。我们曾采用经尾静脉移植异体MSCs治疗大鼠SCI,提示MSCs可迁移到脊髓损伤处,且可表达神经元和胶质细胞特异标志物——神经元特异核蛋白、胶质纤维酸性蛋白;同时也发现细胞迁移率不高,3周时约占移植细胞的4.4%。与静脉移植相比,经蛛网膜下腔移植具有类似优点,其内的脑脊液经过SCI表面,脑脊液比血液体积小,有望减少细胞用量,提高迁移效率。Ohta等发现,采用蛛网膜下腔移植转基因绿色荧光蛋白标记的异体MSCs,3周时,可经损伤的软脊膜到达SCI表面(少数可达其内部);Satake等也证实可达损伤脊髓内部,并分化为神经元巢蛋白阳性细胞。然而我们的结果却表明,SCI表面未见MSCs,这可能与SCI模型制备时打击能量未达100g·cm以上、软脊膜损伤不够大、细胞难以通过有关;或与BrdU标记方法不如转基因绿色荧光蛋白标记敏感有关;也可能与移植细胞数量较少、传代过多有关,需进一步深入探讨。A组动物脊髓组织切片、BBB后肢功能评分的改善,可能得益于MSCs分泌的神经营养因子的局部作用。体外实验亦表明MSCs可以产生多种有利于神经修复的细胞因子。采用异体MSCs治疗,是否引发排斥反应,是另一关心的问题。中枢神经系统通常被认为是“免疫豁免区”,但近年研究表明,在一定程度上中枢神经系统对异体组织也可发生免疫反应。新近发现MSCs有免疫抑制作用,成为研究的又一热点。在体外实验,如混合淋巴细胞培养,不论MSCs分化与否均证实其有免疫抑制作用,但目前MSCs在体内影响免疫系统的研究尚少见。LeBlanc等通过静脉移植异体MSCs成功救治1例严重急性移植物抗宿主病Ⅳ期患者,而其余未采取相同措施的24例患者2个月内全部死亡,提示MSCs有较好的免疫抑制作用。成熟的T淋巴细胞表面均可表达CD3,而CD4及CD8不能同时表达在细胞表面,故可将成熟的T淋巴细胞分为CD4+T细胞及CD8+T细胞两个亚群。血液中T淋巴细胞亚群的检测是观察机体细胞免疫水平简便易行的重要方法。CD4+T细胞主要识别主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)Ⅱ类分子和抗原提呈细胞提呈的外源性抗原,主要表现为辅助和诱导功能(也有一些具有杀伤或抑制功能);CD8+T细胞主要识别MHCⅠ类分子和抗原提呈细胞提呈的内源性抗原,主要表现为杀伤功能。T细胞在急性移植物抗宿主病中起主要作用,CD4+T细胞是关键,CD8+T细胞起促进作用。CD4分子对维持免疫系统的功能有重要作用,希望通过干扰CD4+T细胞,进而破坏细胞免疫功能,达到抗排斥的目的。人外周血中CD4+T细胞较CD8+T细胞多,CD4+/CD8+T细胞的比值为1.4～2.0。若比值偏低,说明免疫排斥反应较弱,反之,则较强。目前尚未见大鼠正常值,但可参考人类数值推测其免疫排斥变化规律。结合我们的研究,A组经蛛网膜下腔注入异体MSCs后,第1周CD4+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值均低于C组,表明机体处于一定免疫抑制状态;第2、3周,CD4+/CD8+T细胞比值变化不大,但CD4+T细胞、CD8+T细胞数量低于B、C组,表明机体仍处于轻度免疫抑制状态,在此期间内经蛛网膜下腔接受异体MSCs不会出现免疫排斥。分析其原因,可能与以下因素有关:①与MSCs表面缺乏(或极低量的表达)MHCⅡ类抗原的表达有关;也不表达共刺激分子B7-1、B7-2、CD40和CD40L,故MSCs不能被异体T细胞所识别。②与MSCs剂量有关,大剂量MSCs抑制而小剂量刺激T细胞增殖,可能是一种超负荷机制,而与主要组织相容性关系不大。③与MSCs产生的细胞因子有关,如转化生长因子α、肝细胞生长因子、转化生长因子β1,因为采用一种半渗透膜将MSCs与淋巴细胞隔离,淋巴细胞的增殖仍受到抑制;也有学者认为与转化生长因子β1无关,在不同条件下,一些细胞因子,如白介素2、可溶性白介素2受体、白介素10、CD2、白细胞功能抗原3的表达增加、减少或不变,提示不同环境下有不同机制,其关键可能还在这些因子的下游区。上述争论说明MSCs的免疫调节机制仍不清楚,在实验中我们推测,可能是MSCs参与分泌的一些可溶性因子随脑脊液循环入血,继而发挥免疫