姜黄素对脊髓钳夹损伤大鼠组织形态结构的影响

姜黄素对脊髓钳夹损伤大鼠组织形态结构的影响

脊柱损伤（pci）可导致不同程度的感觉、运动、括约肌和反射障碍，这在损伤平面以下的神经控制下是不同的。国内外科学家进行了大量的临床和实验研究，但仍缺乏确定的治疗方法。目前甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)冲击疗法治疗脊髓损伤被认为有效,但大剂量MP可产生急性类固醇性肌病、消化道出血、伤口感染等副反应,使用也有严格的时间和剂量限制,在安全性和有效性方面存在质疑。传统中药姜黄是姜科姜黄属多年生草本植物姜黄(curcumalongaL.)干燥梗茎的提取物,主要含姜黄素类包括姜黄素(curcumin,CUR)、脱甲氧基姜黄素(desmethoxycurcumin)和双脱甲氧基姜黄素(bisdesmethoxycurcumin)等,其中姜黄素是其最重要的活性成分,具有抗炎、抗菌、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等多种生物学效应,被用于癌症、自身免疫疾病、糖尿病、动脉粥样硬化、卒中、代谢性疾病等的治疗。本实验应用姜黄素治疗脊髓钳夹损伤大鼠模型,观察大鼠脊髓损伤后组织形态结构的变化以及运动功能的恢复情况,探讨其对SCI修复的作用,为临床应用提供实验依据。1材料和方法1.1动物组和材料1.1.1体质量测定健康SPF级2月龄雌性Wistar大鼠72只(购自第三军医大学实验动物中心)。体质量(200±20)g。按随机数字表法分为6组:单纯损伤(SCI)组、姜黄素预处理(CUR+SCI)组、姜黄素(大、中、小)剂量(SCI+CUR300、SCI+CUR100、SCI+CUR30)组、甲强龙(SCI+MP)组。1.1.2合成工艺-设备姜黄素(Sigma),DMSO二甲基亚砜(Amresco),注射用甲基强地松龙(methylprednisolone,MP),规格40mg/支(天津药业焦作有限公司,批号09032801)。注射用青霉素钠,80万U/支;0.9%生理盐水250ml/瓶(西南药业有限公司生产,批号:10020005);氢氧化钠、多聚甲醛、蔗糖、中性树胶等为国产分析纯试剂。1.1.3冻离心电镜美国BeckmanANANTITM高速低温冷冻离心机,恒冷冰冻切片机(GermanyLeicaCM900),手术显微镜(德国Leica),BX51显微镜(日本OLYMPUS公司)。1.2脊柱钳伤口模型的生产1.2.1小骨肉质瘤t9t10各组大鼠以4%水合氯醛(6ml/kg)经腹腔注射麻醉,8%硫化钠大鼠背部脱毛,无菌条件下俯卧位固定于立体定位仪上,以胸椎T9棘突为中心,背部正中切口,长3～5cm,钝性分离皮下组织及肌肉,暴露T8～T10棘突和椎板,以用特制蚊式钳小心咬除椎板,暴露硬脊膜,将宽度为1.0mm的动脉瘤夹(标定力量为50g)压迫T9～T10脊髓1min,大鼠迅速出现摆尾反射,双后肢及躯体回缩扑动后双后肢瘫痪,提示造模成功。仔细止血并盐水冲洗切口后,用丝线分层缝合肌肉及皮肤,模型制作完成。1.2.2动物治疗及饲养大鼠适应性饲养1周后造模并给药处理,姜黄素以少量DMSO助溶,用生理盐水分别制备成300、100、30mg/kg的溶液。给药:①SCI组:在脊髓损伤后,尾静脉和腹腔注射给予等量生理盐水,连续7d;②CUR+SCI组:脊髓损伤前30min腹腔缓慢推注CUR300mg/kg;③～⑤SCI+CUR治疗组(大、中、小剂量):术后30min内开始每天分别腹腔缓慢推注CUR300、100、30mg/kg,连续7d;⑥SCI+MP治疗组:术后30min内经尾静脉给予MP30mg/kg,此后5.4mg/(kg·h),持续23h,腹腔注射给予等量生理盐水。所有动物在安静、通风、清洁环境下由专业人员单笼饲养。动物饲养环境温度22～25℃,相对湿度在40%～70%,明暗周期12h(6am～6pm),自由饮食,食物为商用大鼠颗粒饲料。每日定时膀胱区按压排尿2次:分别在8:00、20:00。术后3d给予青霉素4万U/只。实验过程中对动物处置符合科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》要求。1.3实验方法受损脊髓组织病理学观察;采用BBB评分法、斜板试验测定后肢运动功能。1.3.1骨髓的内标片制作造模后8周,各组随机取6只,4%水合氯醛按300mg/kg体质量腹腔注射麻醉后开胸,经左心耳心脏插管,快速灌注生理盐水200ml后待右心房溢出无色透明液体后改用4℃4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.4)400ml灌流固定。解剖椎管取出损伤段脊髓,置于4%多聚甲醛液内后固定12～24h,再依次置入20%、30%蔗糖(溶于0.1mol/L的PB中,pH7.2～7.4)脱水至组织块沉入容器底时用OTC包埋取距夹伤处头、尾各0.5cm范围的脊髓,LeicaCM900冰冻切片机作纵行连续切片,贴于涂有多聚赖氨酸的盖玻片上,片厚20μm,每隔6张取1张,每份标本制作8套切片,每套10张,-20℃保存。取1套行苏木精-伊红(HE)染色,以损伤严重段脊髓为中心取视野,光镜下观察病理学变化。1.3.2动物损伤前、后的损伤评分采用BBB(basso,beattieandbresnahan,BBB)评分法和斜板评分法分别在损伤前,损伤后1d、1～8周各周对实验动物进行测定。1.3.2.术后运动情况分别将各组大鼠放置于直径为2m的圆形平台上,连续4min观察其后肢运动情况。根据关节活动、前后肢协调运动、体质量支撑、躯干及尾的位置等情况打分0～21分。0分代表后肢无活动,21分表示后肢活动正常。1.3.2.对大鼠的功能评价采用Rivlin法,将各组大鼠置于1块有纹理的斜板上,当倾斜度由零度缓慢上升至大鼠停留原有位置而不跌落5s时读取斜板度数,每只大鼠重复测试3次取平均值。所有动物在术前进行功能评价,取得正常值范围。评价前所有动物应检查膀胱,防止因过度充盈而影响功能活动,动物尽量保持在活动范围的中心区域活动。BBB评分结束30min后,再进行斜板实验。观察者均为对评分标准十分熟悉的非本组实验人员,采用双盲、双人独立评分,最后取均值。1.4x1显微镜下特殊组织学观察HE染色切片在OLYMPUSBX51显微镜下以损伤段脊髓为中心取视野观察病理学变化并拍照,应用全自动图像处理及分析程序计算空洞面积。1.5统计处理实验数据采用ˉx±s表示,多组数据间比较用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。使用SPSS13.0统计软件统计分析。2结果2.1背侧硬膜与周围粘连大体标本见到脊髓损伤后8周,各组损伤处脊髓缩窄,以瘢痕连接,背侧硬膜与周围软组织有明显粘连。其中,SCI组粘连与缩窄最为明显,SCI+CUR300黏连不明显,缩窄最轻。其余各组介于两者之间。2.2姜黄素治疗髓内损伤的临床效果采用HE染色法在光学显微镜下观察各组脊髓损伤的形态学改变,结果发现:伤后2周,脊髓失去典型形态,神经元固缩、溶解、坏死,病变处出现软化灶,炎症反应重,髓鞘肿胀,大量空泡;损伤中心长梭形成纤维细胞样细胞密度增加。姜黄素治疗后,神经元变性坏死减轻,中性粒细胞浸润较少。提示姜黄素治疗组较单纯损伤组病变、炎症反应轻,可以减轻继发性脊髓损伤(图1)。脊髓损伤后8周(图2),光镜下可见脊髓组织破坏,正常结构丧失,多数神经元胞核溶解,胞浆混浊,尼氏体不可见。紊乱的胶质瘢痕挛缩,形成较大空腔。应用姜黄素后脊髓组织结构比较清晰,较多的正常神经元,细胞核稍浓聚,核膜完整,胞浆内尼氏体可见,胶质瘢痕较规则,组织空洞小于单纯损伤组(P<0.05)(表1)。2.2各组大鼠术后运动功能及临界角度的变化表2所示术前所有大鼠后肢BBB评分均为21分,损伤后1d时各组完全性后肢瘫痪,评分均为0分,伤后1周大鼠后肢BBB评分有所上升,但各组无显著差异,术后第2周,姜黄素治疗组、甲强龙治疗组及姜黄素预处理组大鼠逐渐恢复后肢运动功能,此后各组评分姜黄素治疗组均明显高于甲强龙治疗组,尤以大剂量组效果最好。姜黄素预处理组从4周开始恢复好于单纯损伤组(P<0.05)。正常大鼠斜板实验可达70°～75°,SCI后大鼠斜板实验角度降低至20°提示造模成功。伤后7d开始各组大鼠的临界角度均有所上升,姜黄素治疗组、甲强龙治疗组均高于单纯损伤组,差异有显著性意义(P<0.05),并且随时间变化,各实验组斜板实验角度逐渐增加(表3)。与甲强龙治疗组相比,姜黄素尤其是大剂量组后肢运动功能恢复更好。3姜黄素治疗中的髓伤作用影响脊髓损伤后轴突再生的因素除了神经元自身生长能力有限,缺乏有益的促进因素如雪旺细胞、神经干细胞、营养因子等,还有抑制环境如脊髓继发性损伤及胶质瘢痕、空洞形成以及各种抑制再生的因子的存在。SCI的原发性损伤主要因机械压迫、出血引起轴突断裂,神经元和胶质细胞凋亡和微脉管系统的紊乱,随后的几小时至几天出现血管和生物化学改变,出血性坏死,炎症反应和延迟的脱髓鞘等继发性损伤,最终导致脊髓缺血、变性、坏死,损伤处脊髓软化和囊腔空洞形成。姜黄素在肿瘤、心脏、血管、肝脏等疾病动物实验或细胞模型中有明显的预防和治疗效果,而对脊髓损伤的研究较为缺乏。鉴于临床尚无有效治疗药物,且脊髓损伤在不同时间内发生机制复杂,而姜黄素具有多时程、多靶点、多途径,尝试将其用于治疗脊髓损伤。甲强龙是唯一被临床Ⅲ期证明具有脊髓损伤神经保护作用的药物。本课题用不同剂量的姜黄素治疗组与单纯损伤组、姜黄素预处理组以及甲强龙治疗组做比较,探讨姜黄素对脊髓损伤后病理学的变化和神经功能恢复的影响。本研究发现,病理学上,伤后2周,继发反应严重,应用姜黄素治疗后坏死减轻,炎症反应减弱。伤后8周,大体观察粘连缩窄均不如单纯损伤组明显。光镜下坏死组织降解液化形成空洞,周围环绕致密的胶质瘢痕,姜黄素治疗组空洞明显缩小。这提示姜黄素可抑制炎症反应,减少SCI后组织坏死,缩小空洞范围,有利于轴突的再生。行为学上,各组斜板实验角度和相应BBB评分增长趋势一致,但斜板评分在姜黄素干预后其角度在4周以前上升较平缓,4周后升高幅度加大,说明控制体位的能力在损伤前期恢复稍差,损伤后期恢复好。而姜黄素治疗后BBB评分在2～4周上升较快,此时大鼠已可以行走以及支撑体质量,前后肢的协调运动逐渐恢复。4周后评分升高趋于缓慢,说明精细运动的恢复是一个长期、缓慢的过程。通过对比发现姜黄素预处理和姜黄素治疗均有较好的抑制空洞形成,促进脊髓损伤恢复的作用。表现为明显的减少空洞面积和行为学评分的升高。姜黄素在神经保护的作用优于甲强龙,且效果随药物剂量增加而更加明显。由于姜黄素的安全剂量大,人体实验中以12g/d连续应用3个月被证实安全,无明显不良反应。故认为本实验的药物浓度在姜黄素的安全剂量范围之内。新近有报道对姜黄素在脊髓损伤中的作用进行了探讨,Lin等建立脊髓半横断伤模型,观察到姜黄素对SCI后7d的功能有改善。Cemil等在用70g力的动脉瘤夹钳夹脊髓1min后应用姜黄素,24h后检测组织中酶类变化,行BBB评分,观察到姜黄素能引起生物化学变化,改善脊髓损伤后的早期(24h)功能。由于80%的脊髓损伤是由挫伤而非横断伤引起,本课题采用的动脉瘤钳夹损伤法可以模拟临床骨折脱位或爆裂性压缩骨折等造成的脊髓挤压伤,组织病理学上兼具挫伤挤压伤的特点,且可保持硬脊膜的完整性,更接近临床。与Cemil等的结果不同,我们以50g力的动脉瘤夹造成的损伤在1d时各组大鼠后肢均完全瘫痪,BBB评分均为0分,至1周时间点略有改善,但各组无统计学差异。我们的行为学和形态学观察的时间点涉及脊髓损伤后的急性期(1d、1周)和亚急性期(2～8周),对评价药物对脊髓损伤动物的功能恢复更有说服力。本课题组长期致力于脊髓损伤的研究,已对胶质瘢痕在损伤修复中的作用、血浆白蛋白对小胶质细胞分泌前炎症因子的作用、补体对胶质瘢痕形的作用等进行了系列探讨,本实验是在以往研究的基础上的进一步深化。姜黄素在动物实验中被应用于包括阿尔茨海默病、痴呆、迟发性运动障碍、严重抑郁、癫痫等神经变性和神经精神疾病的研究,并被证实有效。我们前期的研究表明炎症反应、补体