严重创伤大鼠下丘脑热休克蛋白70与诱导型一氧化氮合酶转录表达的变化

严重创伤大鼠下丘脑热休克蛋白70与诱导型一氧化氮合酶转录表达的变化

伤口被认为是“现代文明社会疾病”。严重的伤口会导致许多副作用和副作用。创伤应激时下丘脑作为应激反应的重要调控中枢，下丘脑的损伤和功能异常可能是应激不良发生的重要因素。以往的研究认为一氧化氮（NO）蛐iNOS和HSP70是两种重要的急性期反应蛋白。严重创伤时HSP70与iNOS在下丘脑损伤与抗损伤机制中的作用，目前尚不清楚。本实验采用胸部撞击伤+股骨骨折的多发伤模型，应用免疫组化和原位杂交技术研究严重创伤早期下丘脑内HSP70与iNOS及其mRNA的转录表达情况。材料和方法1常规染色、产物的染色及原位核酸杂交采用3个月龄的健康雄性Wister大鼠63只，体重267.8±13.4g，随机分为正常对照组（6只）和致伤组（48只）。用1.5%戊巴比妥钠（20mg蛐kg）麻醉，对照组只麻醉不致伤。创伤组麻醉后，应用BIM-Ⅲ型生物撞击机撞击大鼠右胸中上1蛐3交界处。弹道压力420kPa，弹距1cm。撞击后立即折断一侧股骨中段。分别于伤后0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h和24h活杀，用4%多聚甲醛DEPC固定液经心脏灌注固定，解剖并开颅取脑组织，恒冷冰冻切片行常规染色和特异性染色。其中9只大鼠下丘脑标本经戊二醛、锇酸后固定行电子显微镜观察。采用S-ABC免疫组化染色法。试剂为Sigma公司的小鼠抗HSP70抗体及博士德公司免疫组化染色试剂盒。将冰冻切片经新鲜配制的0.3%H2O2甲醇处理后滴加封闭液，室温10min，滴加小鼠抗大鼠的抗体，0.01MPBS洗涤。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG。滴加试剂SABC，洗涤后DAB显色，苏木素轻度复染。对照实验于作用液中不加一抗，结果均为阴性。应用原位核酸杂交技术。试剂为博士德公司的ISHDetectionKit，其探针为地高辛标记的寡核苷酸探针。将经甲醇处理的冰冻切片，胃蛋白酶37℃消化3min，预杂交2h。滴加20μl含地高辛标记探针的杂交液，恒温箱38℃杂交20h。37℃水温的2×SSC洗涤。滴加杂交稳定液。滴加封闭液，滴加兔抗地高辛，滴加生物素化山羊抗兔IgG,滴加试剂SABC,洗涤后DAB显色。苏木素轻度复染。对照实验采用不含探针的杂交液，结果均为阴性。将不同时相点的免疫组化、原位杂交的图像输入计算机，求出单位面积中阳性细胞数，应用Tiger图像分析系统测定染色强度。所得数据用医学数理统计程序进行统计分析，结果以均数±标准差（x±s）表示。肺损伤的部位及创伤评分（1）创伤后即刻出现呼吸暂停，一般持续20秒～1min继之逐渐出现深慢呼吸及随后的长时间持续性浅快呼吸越60～90次蛐min。（2）心动过速，心率大于200次蛐min。（3）解剖见右肺两叶以上大片状出血，一般肺根部伤情最严重（受力中心点），部分动物出现左上肺出血或水肿（可能为胸腔对冲伤所致），气管和支气管内可见血性或泡沫状分泌物，个别出现肋骨骨折、血气胸及皮下气肿，股骨骨折位于中段血肿量2～3ml。创伤评分ISS=18，死亡率在20%，主要死因为心跳骤停、急性呼吸衰竭及血气胸等。创伤后下丘脑组织大体及光镜观察细胞形态正常，未见组织水肿、出血、坏死等病理改变。电镜观察仅见下丘脑细胞内线粒体轻度肿胀。2.hsp80的表达正常对照组下丘脑HSP70仅为低水平的基础表达，而iNOS则无基础表达。HSP70主要在神经元内表达，位于胞浆及突起处，主要集中于室旁核；而iNOS在胶质细胞和神经元中均有表达，染色细胞体积较小，在下丘脑分布广泛。创伤后1h下丘脑内HSP70普遍性表达增强（P<0.05),6h达到高峰（18倍）,24h阳性细胞数减少,主要集中在下丘脑室旁核，而且室旁核特异性染色强度更高（3.5倍），其它部位明显减弱减少仅见痕量表达（图1）。iNOS在正常对照组及创伤后0.5h内均未见阳性染色，创伤后1h开始出现，2～6h明显增多增强（P<0.05），其高峰期出现在8h(增加13倍)，24h表达有所下降（图2）。HSP70和iNOS两者表达量呈正相关，相关系数γ=0.97601。3inosmrna转录正常对照组HSP70mRNA转录水平仅为痕量，在创伤后0.5h即开始增加，4h达到高峰（11倍），6h以后稳定在较高水平（6倍）。iNOSmRNA转录在创伤后1h才开始出现仅为痕量，4h达到高峰（13倍），以后稍有下降。两者的原位杂交的阳性分布区与免疫组化染色相仿。hsp60与inos的相互作用本实验采用胸部撞击伤+单侧股骨骨折的动物模型来研究严重创伤应激反应，避开了机械力对下丘脑的直接损伤，重点突出了下丘脑在调节整体创伤应激中的病理生理改变，具有较普遍的代表意义。致伤后下丘脑的大体及光镜标本均未发现有明确的形态学改变，电镜下仅见轻微的线粒体肿胀，线粒体是对损伤最敏感的细胞器。同时发现HSP70和iNOS转录表达异常增高。这表明下丘脑对严重创伤的早期反应主要是代谢和功能发生了改变，出现某些急性期基因表达及急性期蛋白合成增加。创伤产生的疼痛、失血缺氧、炎性因子等因素可引起中枢兴奋性神经递质释放或直接作用于下丘脑。其中炎性因子可以通过iNOS介导而造成神经细胞的损害。文献报道细胞在受到内毒素等炎性因子刺激后2h才开始表达iNOS。本实验发现iNOS在创伤后1h即开始出现，高峰期出现在8h。与文献报道相比出现时间早持续时间长。其发生机制尚不清楚。由于炎性因子的大量合成需要在创伤后一定时间后发生，因此推测早期的iNOS产生与中枢兴奋性递质增高及失血缺氧有关（作用迅速），而其持续高水平表达则由随后大量产生的炎性因子所致。iNOS的特点是能高效快速产生大量NO，造成或加重神经细胞兴奋性损伤。Boczkowsk等和Tatsumi等均报道iNOS产生的NO直接抑制线粒体呼吸链，导致细胞内ATP水平降低、能量失衡，威胁着细胞内环境稳定性及细胞的完整性。HSP70的保护作用一般是通过分子伴侣作用，使蛋白质正确折叠、组装及转位，维护细胞功能和生存的。此外，HSP70尚可提高细胞对低浓度ATP的耐受性，帮助线粒体恢复损伤。Moro等研究发现两分子的HSP70与基质Tim44结合成转运复合体，使多肽链得以进入线粒体内。以往的研究认为神经元HSP70的表达与神经元的兴奋性损伤密切相关。如Lowenstein等研究发现HSP70表达多出现在易因过度兴奋而产生损伤的神经元内，而Tomimoto等发现神经元受到可逆性或不可逆性损害时HSP70表达均可上调，但前者更明显。我们发现严重创伤后下丘脑HSP70增强，尤其是室旁核阳性细胞最多，且表达强度最高。表明室旁核内的神经元在严重创伤时兴奋性最强，持续时间最长，可能存在兴奋性损伤。由于室旁核含有重要的神经内分泌细胞，是调控应激激素分泌的关键部位，若出现兴奋性损伤必然导致应激反应异常。HSP70除具有重要的抗损伤作用外，可能还与调节下丘脑的神经内分泌功能有关。最近的研究表明，HSP70和iNOS之间尚存在着相互作用机制。如Calabrese等在实验中观察到经LPS、α-INF处理的星形胶质细胞产生的iNOS与HSP70应激蛋白的合成增加相关联，应用iNOS抑制剂L-NMMA则HSP70合成减少；添加NO供体硝普钠可使HSP70表达呈剂量依赖性增高。因此Calabrese认为iNOS可以诱导HSP70的生成，而Lau等发现HSP70含量的增加导致iNOS活性的降低及减少iNOS后继合成。Bellmann等认为HSP70通过特异性上调P38信号传导通路来调节iNOS的表达和活性。我们在实验中发现HSP70和iNOS在创伤后表达部位重叠，同步增多呈显著相关，推测严