液相色谱法测定牛奶中替米考星、泰乐菌素和螺旋霉素的残留量

液相色谱法测定牛奶中替米考星、泰乐菌素和螺旋霉素的残留量

氨基硅酮、天竺葵素和螺旋霉菌属于16位环内酯类抗生素。该类药物广泛地用作兽药或饲料添加剂,预防和治疗牛、羊、猪、鸡等动物的感染性疾病,替米考星和泰乐菌素被广泛的加入到饲料用作生长促进剂。这些药物随动物性食品进入人体后不仅会产生直接的毒性,还会发生过敏反应及产生耐药细菌。为保护食品安全和人类生命健康,很多国家如加拿大、欧盟、美国、日本等国对该类药物设置了较低的最高残留限量,如欧盟对该类药物最高残留限量作了明确的规定,在肉制品中替米考星为50μg/kg,泰乐菌素为100μg/kg,螺旋霉素为200μg/kg。因此迫切需要研究一些高灵敏度、快速的方法对该类药残进行检测监控。国外已有一些相关检验方法,如使用液质联用法(LC/MS)检测红霉素和螺旋霉素。国内目前此类药物的相关检验标准缺乏,只有螺旋霉素和泰乐菌素有SN标准,且都是使用微生物杯碟法,检验周期长,灵敏度也不够高。国内对该类药物检测方法的报道较少。1实验部分1.1螺旋霉素和泰乐菌素螺旋霉素(Spiramycin)、泰乐菌素(Tylosin)、替米考星(Tilmicosin)均购自Dr.Ehrenstorfer。螺旋霉素(Spiramycin)和替米考星(Tilmicosin)纯度均大于98.5%,泰乐菌素(Tylosin)纯度大于95%。Na2HPO4、NaH2PO4、柠檬酸、三氟乙酸、正已烷均为分析纯,甲醇和乙腈为色谱纯。1.2萃取条件和萃取小柱安捷伦1100高效液相色谱仪(配有二极管阵列检测器),离心机(最高转速4500r/min),高速均质器(最高转速20000r/min),固相萃取装置,固相萃取小柱:BondElutSCX苯磺酸阳离子交换柱(3mL,500mg)或相当者,BondElutC18柱(3mL,500mg)或相当者,氮吹仪,旋转蒸发仪,振荡器。1.3osol/l流动相水相(以下简称溶液A):称取7.8g二水磷酸二氢钠用去离子水溶解定容至1L,用三氟乙酸调节pH到2.6,用0.45μm滤膜过滤后备用,溶液的最终浓度为0.05mol/L。0.1mol/L柠檬酸溶液:称取21g一水合柠檬酸用去离子水溶解定容至1L,调节pH至4.0。0.1mol/L乙酸铵甲醇溶液:称取7.7g乙酸铵溶解于1L甲醇溶液中。标准溶液:准确称取一定量的大环内酯类标准品,溶解于适量甲醇中,配制成100mg/L,放置于冰箱中冷冻保存(保存期:6个月),使用之前回温到室温。标准工作溶液的配制:准确称取一定量的100mg/L大环内酯类标准储备液,用(1+1)甲醇水溶液逐级稀释到相应标准工作溶液,放置于冰箱中冷冻保存(保存期:1个月),使用之前回温到室温。1.4柠檬酸溶液加入量先将牛奶样品4℃4000r/min离心10min去脂肪。量取20mL去脂肪牛奶于50mL塑料离心管中,加入20mL柠檬酸溶液旋涡混合1min,振荡10min。向混合液中加入5mL正已烷,旋涡混合1min,4000r/min离心5min,弃去正已烷,再加入5mL正已烷重复处理一次,取20mL下层水溶液于另一50mL离心管中,加入10mL正已烷,旋涡混合1min,4000r/min离心5min,弃去正已烷,水相准备过柱。1.5净化柱的制备依次用6mL甲醇、6mL柠檬酸溶液活化柱子,然后将上述样液转移至BondElutSCXSPE固相萃取柱上,用9mL水淋洗柱子,用6mL0.1mol/LpH9.2Na2HPO4溶液中和小住,弃去流出液。分析物用10mL0.1mol/L乙酸铵甲醇溶液洗脱并收集,洗脱液用45℃氮气流吹干。残留物用1.0mL0.1mol/LNa2HPO4溶液溶解,过0.45μm微孔滤膜,滤液供液相色谱测定用。1.6流速和检测波长色谱柱:ZORBAXEclipseXDBC18柱(4.6mmi.d.×150mm,5μm);流速:1mL/min;柱温:35℃;进样量:50μL;检测波长:替米考星和泰乐菌为285nm,螺旋霉素为232nm;流动相:0.05mol/LNaH2PO4溶液(A)-乙腈(B),0min22%B,15min35%B,Runtime20min,postrun5min。2结果与讨论2.1离心除脂肪现有提取方法多为酸性提取和甲醇或乙腈提取。本研究采取4℃离心有效去掉牛奶中大部分脂肪,再用正已烷进一步去掉脂肪。将离心后的牛奶直接加柠檬酸混匀过柱,整个提取步聚简单,有效的减少了样品损失及样品分解,显著提高了回收率。2.2色谱柱的选择对3种大环内酯类标准物质进行紫外可见光谱扫描,替米考星、泰乐菌素和螺旋霉素的最大吸收波长分别为285、285、232nm。研究开始时直接用0.05mol/LNaH2PO4溶液作为流动相A,不调pH,此时pH约为4.5,流动相组成为40%B,前面的色谱峰分离不好,而泰乐菌素出峰时间又太晚,超过30min。第二次经过反复调pH,确定pH2.6时(一般的色谱柱适用的pH范围为2～9),分离较好,出峰时间令人满意,再经过调整流动相的梯度,最终使3个目标峰均与杂质峰很好的分离,螺旋霉素、替米考星和泰东菌素出峰时间分别为:6.9、11.9、15.5min,详见图1。本研究中比较了日本NacalaiTesque公司的CosmosilC18-MS-Ⅱ柱,资生堂的CAPCELLPAKC18柱,安捷伦的ZORBAXEclipseXDBC18柱,规格为4.6mm×150mm,5μm和4.6mm×250mm,5μm。250mm柱出峰时间太长,选用150mm柱长。实验结果表明使用上述3种柱均能使目标物分离,资生堂的CAPCELLPAKC18柱峰形较好,对称性好,但价格昂贵,最后确定用安捷伦的ZORBAXEclipseXDBC18柱,规格为4.6mm×150mm。2.3净化效果的分析按照文献方法分别使用C18固相萃取柱和SCX固相萃取柱进行净化。实验结果表明用C18小柱净化效果不佳,杂质峰太多太大影响目标峰的灵敏度和准确定量,背景干扰非常大,根本无法检测。而SCX柱净化效果令人满意,谱图干净,检测灵敏度高,详见图2、图3。因大环内酯类抗生素是弱碱性化合物,用pH4.0的柠檬酸使其离子化带正电荷,易溶于水,在过柱时吸附在SCX阳离子交换柱上。用pH9.2的磷酸盐缓冲液过柱的目的是中和SCX柱,使目标物容易洗脱。经过实验发现6mL磷酸盐缓冲液中和正好,太少中和不完全,难于洗脱,回收率低,太多会引起目标物穿透,回收率也会降低。最后用0.1mol/L乙酸铵甲醇溶液洗脱,加入乙酸铵的目的是增加溶液离子强度,使目标物更易洗脱,提高回收率。2.4菌素检出限及线性方程在空白牛奶中添加标准品做检出限实验,信噪比按3∶1计算,螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素检出限分别为30、20、40μg/kg,线性范围为20～800μg/kg。线性方程分别为:y=5.2418ρ-0.5913,y=5.2841ρ-0.5009,y=3.1