耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药机制研究

耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药机制研究

此前，氨基乙醇药物已发展到第四代，但在第三代之后的药物中，它具有抗分枝杆菌的活性。DNA旋转酶A(gyrA)是结核分枝杆菌中喹诺酮类药物的首要作用靶位,结核分枝杆菌对喹诺酮类药物的耐药主要与编码该酶的gyrA基因耐药决定区碱基突变有关。为建立一种简便、快速、可靠的结核分枝杆菌gyrA基因突变的检测方法,并进一步探讨该突变与我国结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的关系及其耐药株的地理分布,本研究以四川地区结核分枝杆菌临床分离株作为研究对象,采用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)结合DNA测序技术,对gyrA基因耐药决定区突变进行了研究。1材料和方法1.1材料表面1.1.1冠心病防治院和结结所院68株临床结核分枝杆菌来自成都市结核病防治院和四川省结核病预防与控制中心;结核分枝杆菌标准株H37Rv来源于中国药品与生物制品检定所。1.1.2pcr试剂及小量胶回收试剂盒药物纯品氧氟沙星、环丙沙星和司帕沙星购自美国BectonDickinson公司,pfuDNA聚合酶及其他PCR相关试剂(BBI),小量胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司),丙烯酰胺和双丙烯酰胺(上海生工),核酸分子量标准(MBI),其余试剂均由国产或进口分装。1.2方法1.2.1确定细菌和药物过敏试验参照全国结核病细菌学检验标准化规程进行分枝杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验。1.2.2esno.al20叶片的设计根据GenBank中Cole等报道的结核分枝杆菌H37Rv株全基因组序列(GenBankaccessionNo.AL022076)进行设计。引物序列如下:引物1:5′-cgggtgctctatgcaatgttc-3′;引物2:5′-ctggcgagccgaagttgc-3′用于扩增gyrA耐药决定区,产物长度为199bp。以上引物均由上海生物工程公司合成。1.2.3k-sds-酚制备参照Husson等介绍的方法,收集培养细菌,灭活后置洁净的研磨器中进行适当研磨,将研磨后的菌液转入印管中,加入溶菌酶、蛋白酶K和SDS,其终质量浓度分别为5μg/ml、100μg/ml和40g/L,37℃孵育过夜,次日以酚∶氯仿抽提,无水乙醇沉淀,真空冻干,溶于50μl1×TE,-20℃贮存备用。1.2.4pcr检测pif基因聚合酶表达使用H37Rv基因组为模板作为阳性对照,使用无菌去离子水代替模板作空白对照。在50μl反应体系中,4×dNTP的终浓度各为0.2mmol/L,引物的终浓度各为0.6μmol/L,纯化的DNA模板10~100ng,pfuDNA聚合酶终浓度0.05U/μl。于Eppendorf公司PCR扩增仪上进行PCR扩增,循环参数为:94℃预变性3min,然后94℃变性1min,55℃复性30s,72℃延伸1min,共30个循环,最后延伸7min。取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶(15g/L)电泳检测。1.2.5非变性聚丙烯酰胺凝胶法取5μl上述PCR产物,加等体积的甲酰胺变性液(980ml/L甲酰胺,10mmol/LEDTA,0.25g/L溴酚蓝,0.25g/L二甲苯腈FF)混匀,95℃变性10min,立即置冰浴2min,上样于预冷至4℃预电泳30min的80g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶上,4℃,50V电泳8h,直至二甲苯腈FF接近凝胶底部为止。EB染色30min,紫外检测,成像。1.2.6序测量PCR产物电泳,使用小量胶回收试剂盒回收目的条带,将纯化后的PCR产物送上海生物工程公司测序。2结果2.1药物敏感试验68株结核分枝杆菌临床株中,24株氧氟沙星、环丙沙星和司帕沙星的MIC分别小于1μg/ml、1μg/ml和0.5μg/ml,为药物敏感株;19株氧氟沙星、环丙沙星和司帕沙星的MIC分别大于/等于1μg/ml、1μg/ml和0.5μg/ml,而小于10μg/ml、10μg/ml和5μg/ml,为低耐药株;氧氟沙星、环丙沙星和司帕沙星的MIC至少一种分别等于/大于10μg/ml、10μg/ml和5μg/ml,为高耐药株,共25株。2.2pcr检测dnaPCR产物经15g/L的琼脂糖凝胶电泳,68株结核分枝杆菌临床分离株及标准株均扩增出大小约200bp的片段,无gyrA片段的缺失,空白对照无条带。结果见图1。M:DNAmolecularweightmarker(100bpladder);1:PCRproductofgyrAgeneamplifiedfromH37Rvstrainusedaspositivecontrol;2:Blankcontrol;3-7:PCRproductsofgyrAgeneamplifiedfromclinicalisolates2.3药物敏感的粘结分枝杆菌h23rv结果68株结核分枝杆菌临床株扩增的gyrA基因片段经过PAGE电泳后,与药物敏感的结核分枝杆菌标准株H37Rv结果对比,图形相同者为阴性,结果不同者为阳性。其中22株为阴性。46株为阳性,根据条带的形状,可将阳性株分为不同的4种类型。结果见图2。2.4药敏试验结果根据SSCP条带形状,4种类型的阳性组分别随机选取一株测序,结果分别为Ser95Thr、Asp94Gly、Ala90Val、Ala83Val突变,包括25株高耐药株、11株低耐药株和10株药物敏感株检测到gyrA基因突变,高耐药株突变率为100%,低耐药株突变率为58%,敏感株突变率为42%,总的突变率为68%。Ser95Thr突变10株均为药物敏感株,Asp94Gly突变10株,其中6株为高耐药株,4株为低耐药株,Ala90Val突变11株,其中4株为高耐药株,7株为低耐药株,Ala83Val突变15株均为高耐药株。M:DNAmolecularweightmarker(100bpladder);1:SSCPpatternforPCRproductofgyrAgeneamplifiedfromH37Rvstrainusedaspositivecontrol;2-6:SSCPpatternsforpartialPCRproductsofgyrAgeneamplifiedfromclinicalisolates3川地区结核杆菌gyra基因的roi突变检测随着全球结核病疫情的回升和耐多药菌株的扩散,耐药结核分枝杆菌的感染已经成为结核病化疗失败的重要原因,对于耐异烟肼、利福平的耐多药结核病和由于肝功能异常或高龄者应用喹诺酮类药物方案现已成为治疗的主要选择。其中以1993年上市的日本生产的斯帕沙星(sparfloxacin)抗结核杆菌作用为最强。随着喹诺酮类药物的广泛使用,耐药菌株也日渐增多,严重影响其疗效和临床应用。近年来的研究表明结核分枝杆菌耐喹诺酮与gyrA基因突变有关,从而发展了一些分子生物学的药敏检测方法,聚合酶链反应单链构象多态性技术(PCR-SSCP)就是其中之一。本研究首次以四川地区结核杆菌临床株为研究对象检测gyrA基因的QRDR,根据SSCP条带形状共分出了4种类型的阳性结果,说明该地区结核杆菌gyrA基因QRDR至少存在4种基因突变,经过药敏试验和测序发现,同一菌株中只存在一种单一的突变,Ser95Thr突变10株均为药物敏感株,说明其变异与结核杆菌耐喹诺酮类药物无关,可能为菌株间的基因多态性,Ala83Val突变的15株均为高耐药,Asp94Gly和Ala90Val突变既有高耐药株,也有低耐药株,而高耐药100%都检测出了基因突变,提示高耐药与基因突变关系密切,gyrA基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制,耐药突变位点与耐药性高低之间是否有差异,有待提高标本数量作进一步的研究。初步发现Ala83Val突变在该地区与高耐药关系更密切。PCR-SSCP在近年来广泛用于核酸突变的检测,它利用单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率与一级结构序列密切相关的原理检测基因突变,具有快速、准确、简单的特点,但其影响因素很多,条件选择是实验成败的关键。本研究选用的实验条件能很好地鉴别单核苷酸的变异,适用于结核分枝杆菌临床分离株耐药性的快速检测,对指导临床用药具