复方替米考星纳米乳的制备及品质评价

复方替米考星纳米乳的制备及品质评价

纳米乳液是由油相、水相、乳化剂和辅助乳化剂以适当比例混合而成的透明或透明、低粘度动态和力学稳定体系。大量资料表明,纳米乳具有制备简单,安全性高,热力学稳定,增加难溶性药物溶解度,提高易水解药物稳定性,缓释,靶向,提高药物生物利用度等优点。替米考星(Tilmicosin)是一种以泰乐菌素为前体半合成的大环内酯类畜禽专用抗生素,其抗菌活性与泰乐菌素相似,对细菌包括革兰氏阳性菌以及部分革兰氏阴性菌、支原体螺旋体均有很强的抑制作用,特别对猪的胸膜肺炎放线杆菌、畜禽巴氏杆菌及支原体具有比泰乐菌素更强的抗菌活性。替米考星极微溶于水,临床常用其磷酸盐,该盐存在吸收不完全,生物利用度低,不能充分发挥抗菌作用等缺点。因此,亟需提高其水溶性和生物利用度。氟苯尼考(Florfenicol)为人工合成的甲砜霉素单氟衍生物,是新一代氯霉素类动物专用广谱抗生素。其抗菌活性明显优于氯霉素和甲砜霉素,对支气管败血波氏杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、沙门菌、大肠埃希菌等革兰氏阳性和阴性细菌及支原体均有强大的抗菌能力。目前,该药在兽医临床上应用非常广泛,但该药几乎不溶于水,口服生物利用度很低,故提高该药的生物利用度对其在兽医临床上的应用具有重要意义。另外,随着用药的增多,临床上对氟苯尼考耐药的细菌也开始出现,这些耐药菌株势必给临床治疗带来困难。将替米考星和氟苯尼考进行配伍,则会降低用药量,减少或延缓耐药菌株的产生。但目前有关替米考星和氟苯尼考复方制剂的研制尚未见报道。为此,本研究将替米考星和氟苯尼考配伍,制备成复方替米考星纳米乳,并对其稳定性进行考察,以期为兽医临床提供一种广谱、高效、安全、稳定的纳米级复方抗菌药物。1材料和方法1.1药物、试剂和仪器吐温-80(Tween80)、司盘-80(Span80),化学纯,天津市登封化学试剂厂生产;蓖麻油聚氧乙烯醚(EL-40)、聚氧乙烯醚-40氢化蓖麻油(RH-40),上海昌为医药辅料技术有限公司生产;乙酸乙酯、无水乙醇、1,2-丙二醇(PG)、1,3-丁二醇和聚乙二醇(PEG400)均为分析纯,西安化学试剂厂生产;肉豆蔻酸异丙酯(IPM),药用级,陕西省医药公司生产;亚甲基蓝和苏丹红,北京化学试剂公司生产;替米考星原料药,山东齐鲁制药有限公司生产;柠檬酸,天津市东丽区天大化学试剂厂生产。JEM1230型透射电子显微镜,日本日立电子公司生产;EB-280型电子天平,日本shimadzu公司生产;TGL-16B型高速离心机,湖南星科科学仪器有限公司生产;SKP02.420电热恒温培养箱,黄山市恒丰医疗器械有限公司生产;XSZ-HS7偏光显微镜,重庆光学仪器厂生产;ZetasizerNanoZS型激光粒度分析仪,英国MalvernInstrument公司生产。1.2纳米乳液的共轭反应1.2.1复方替米考星纳米乳的油相的确定取IPM、石蜡油、橄榄油、精制麦芽油、霍霍巴油、大豆油、花生油、乙酸乙酯分别置于具塞锥形瓶中,加入过量的替米考星,37℃水浴条件下超声(30Hz,50W)溶解20h后,观察替米考星在油相中的溶解度,确定复方替米考星纳米乳的油相。1.2.2助表面活性剂的确定室温下,考察PEG400、无水乙醇、丙三醇、1,2-丙二醇、无水乙醇与1,2-丙二醇的混合物[m(无水乙醇)∶m(1,2-丙二醇)=3∶2]对替米考星的溶解度,确定溶解度较大的作为助表面活性剂。1.2.3纳米乳的界面张力表面活性剂是形成纳米乳的关键组分,通过界面吸附,使油水界面张力大幅度下降,甚至降至超低界面张力,促进纳米乳的形成。以Km表示表面活性剂与助表面活性剂的质量比,固定Km值为6∶5,选用Tween80、EL-40、Span80和RH404种非离子表面活性剂进行筛选,根据筛选出的油相、助表面活性剂,绘制伪三元相图,分别考察它们对纳米乳形成的影响。1.2.4最佳算法确定将表面活性剂与助表面活性剂按2∶1、3∶2、6∶5的质量比混匀,作为混合表面活性剂,根据“1.2.1”、“1.2.2”、“1.2.3”的筛选结果,绘制伪三元相图,研究最佳Km值。1.2.5复方替米考星纳米乳的增溶剂的筛选由于替米考星在筛选的油相、乳化剂和助乳化剂中的溶解度不能满足临床给药要求,因此根据其溶解性质,筛选复方替米考星纳米乳的增溶剂。分别选取柠檬酸、磷酸、酒石酸作为增溶剂,观察替米考星在不同增溶剂中的溶解度。以乳化剂/油相/蒸馏水体系为药用纳米乳基质,考察质量分数分别为1.00%、1.60%、2.00%、2.80%、4.90%、6.30%和10.00%的柠檬酸对纳米乳形成的影响。1.2.6剂、油相质量比对纳米乳体系组分内含水量的影响选定适当的增溶剂、乳化剂和油相后,通过伪三元相图确定复方替米考星纳米乳的形成区域及处方成分的用量。室温下,将确定的乳化剂和油相分别按质量比9.7∶0.3、9.4∶0.6、9∶1、8.7∶1.3、8.5∶1.5、8∶2和1∶9混匀,然后逐滴加入蒸馏水,直至形成透明、澄清纳米乳。记录当体系由混浊变澄清或由澄清变混浊时的临界点水量,并计算体系中各成分的质量分数。分别以乳化剂、油相、水相作为相图的3个顶点,利用OriginPro7.5软件绘制伪三元相图,确定乳化剂和油相的比例。1.2.7复方替米考星纳米乳的制备根据配方初步筛选结果,采用转相乳化法制备复方替米考星纳米乳。具体制备方法:室温条件下,先将替米考星完全溶于助表面活性剂和增溶剂,再逐滴加入氟苯尼考溶液,然后加入表面活性剂和油相,混匀,逐滴加入蒸馏水,其间不断搅拌,直至形成均匀透明体系,即复方替米考星纳米乳。1.3联合评价星纳米乳液质量分析1.3.1纳米乳的判定采用离心法对纳米乳的类型进行鉴别。将制备的纳米乳于4000r/min离心20min,观察是否分层,如仍维持透明可判定为纳米乳。纳米乳类型的鉴别采用染色法,根据红色的油溶性染料苏丹红Ⅲ和蓝色的水溶性染料亚甲兰在纳米乳中扩散的快慢来判断,如果蓝色的扩散速度大于红色,则纳米乳为O/W型;反之则为W/O型,若二者速度相同则为双连续型。1.3.2纳米乳液电镜观察参照文献,用透射电镜检测纳米乳的形态,取替米考星纳米乳适量,用蒸馏水稀释10倍后,滴在覆有支持膜的铜网上,静置10min后用滤纸片吸干,再滴加20g/L磷钨酸溶液(pH为7.4)于铜网上负染3min,自然挥干,在电镜下观察纳米乳液滴的形态。1.3.3粒度分析取适量复方替米考星纳米乳,用蒸馏水稀释10倍,用激光粒度分析仪测定其粒径分布。1.3.4稳定纳米乳的检测外观:肉眼观察纳米乳的外观,若澄清透明,表明稳定性良好;若出现浑浊、絮状沉淀或分层,则表明不稳定。高速离心试验:将纳米乳置于离心管中,放入高速离心机,于13000r/min离心20min,观察是否有沉淀、浑浊、分层等现象发生。若外观透明、流动性良好,100g离心5min,若不发生相分离,即为稳定纳米乳。加速试验:将复方替米考星纳米乳分别于高湿(92.5%)、高温(40℃)、常温及光照(4500±500)lx环境下进行影响因素试验,于第1天、第5天和第10天取样,考察其外观;取纳米乳置离心管中,13000r/min下离心20min,观察是否有沉淀、浑浊、分层等现象发生。2结果与分析2.1处方筛选2.1.1油相筛选结果表明,替米考星在IPM中的溶解度较大,IPM适合做为体系的油相。2.1.2无水乙醇与1,2-丙二醇混合体系的筛选筛选结果表明,替米考星在无水乙醇或1,2-丙二醇中均有一定的溶解度,在无水乙醇与1,2-丙二醇的混合体系[m(无水乙醇)∶m(1,2-丙二醇)=3∶2]中溶解度最大,故选取此混合体系为助表面活性剂。2.1.3区域及大小分析以RH40为表面活性剂所制备的溶液不稳定,24h后溶液变浑浊。其余3种表面活性剂的纳米乳乳区范围见图1(伪三元相图中曲线和水相顶点围成的阴影部分即为纳米乳乳区)。微乳区大小表现为Tween80>EL-40>Span80(图1)。3种表面活性剂所形成的纳米乳体系都可以被水稀释至顶点并保持澄明状态,但Tween80载药量最大。因此,选用Tween80为表面活性剂。2.1.4最佳距离值由图2(阴影部分为纳米乳区)可知,Km为6∶5时微乳区最大。因此,最佳Km值为6∶5。2.1.5柠檬酸纳米乳的稳定性质量分数为1%的柠檬酸不能形成纳米乳,质量分数为4.90%、6.30%和10.00%的柠檬酸能够形成纳米乳,但所形成的纳米乳不稳定。质量分数为1.60%、2.00%和2.80%的柠檬酸均能形成纳米乳,且形成的纳米乳稳定,考虑到成本及载药量因素,选用质量分数为1.60%的柠檬酸作为增溶剂。2.1.6表面活性剂与油的质量比对纳米乳品质的影响以替米考星为主药,氟苯尼考为辅药,Tween80为表面活性剂,乙醇、1,2-丙二醇为助表面活性剂,柠檬酸、二甲基亚砜为增溶剂,IPM为油相所制备的纳米乳,外观透明、粘度小、性质稳定。当表面活性剂与油的质量比为9∶1、Km=6∶5时,制备的纳米乳粒径最小、性质最稳定,替米考星载药量最高。由此可知,替米考星纳米乳的最佳配方为:替米考星11.07%、氟苯尼考1.11%,二甲基亚砜1.11%、无水乙醇13.29%、1,2-丙二醇8.86%,柠檬酸1.64%,Tween8026.58%、IPM5.32%、蒸馏水31.02%(以上各组分均为质量分数)。2.2联合评价星纳米乳液质量分析2.2.1复方替米考星纳米乳按上述配方制备的药液,以4000r/min离心30min后,仍为澄清透明的淡黄色液体,未见分层现象,判定该液体为复方替米考星纳米乳。染色结果显示,在复方替米考星纳米乳中亚甲基蓝的扩散速度大于苏丹红,表明该体系为O/W型纳米乳。2.2.2该形状复方替米考星纳米乳在透射电镜下呈规则球形,液滴分布均匀,无团聚,无粘连现象(图3)2.2.3多分散系数及粒度分布粒度分析仪测定结果表明,复方替米考星纳米乳平均粒径为15.4nm;多分散系数(PDI)为0.08;粒度分析表明,小于10nm的粒子占3.2%,大于25nm的占4.3%,粒度分布在10～25nm的占92.5%。可见所得纳米乳的粒径分布范围较窄,基本呈正态分布(图4)。2.2.4均一液体稳定性试验替米考星纳米乳的外观为淡黄色澄清透明液体,无浑浊、絮状、分层等现象;13000r/min离心20min后,仍为淡黄色澄清透明均一液体,表明其稳定性良好。加速试验表明,在不同时间取样观察,复方替米考星纳米乳外观仍保持澄清透明,该体系受温度、光照、湿度影响较小,经13000r/min离心20min后仍保持澄清、透明,未见絮状沉淀,油水分层等现象,说明该纳米乳稳定性良好。3替米考星与氟苯尼考配伍替米考星和氟苯尼考均是临床广上泛使用的抗菌药物,具有抗菌谱广,杀菌力强,作用迅速等特点。替米考星对巴氏杆菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌均具有较强的抑制和杀灭作用,主要用于治疗动物肺炎、急慢性呼吸道疾病和泌乳动物的乳腺炎。氟苯尼考对猪胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血波氏杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠埃希菌等革兰阳性和阴性细菌及支原体均有强大的杀伤力。但是,随着长期广泛的使用,许多病原菌已对这2种药物产生了耐药性,从而导致临床治疗效果降低。本试验依据联合用药理论,将替米考星与氟苯尼考进行配伍,通过二者的协同作用,扩大了抗菌谱,增强了抗菌活性,减少了耐药菌株的产生,同时为克服替米考星和氟苯尼考溶解性差的缺点,提高制剂的稳定性,将其制备成纳米乳制剂。纳米乳制备中最重要的是处方组分及其比例的确定。处方组分及其比例不恰当,就不能生成纳米乳或生成的纳米乳区小,达不到增加难溶性药物溶解度、增加药物稳定性、提高生物利用度的目的。纳米乳通常由表面活性剂、助表面活性剂、油相、水相等组分在适当质量比下自发形成。水、表面活性剂和油相是纳米乳形成所必需的处方组分,主要影响纳米乳体系的形成、稳定性和载药量。本研究选定柠檬酸为增溶剂,Tween80为表面活性剂、无水乙醇与1,2-丙二醇混合体系为助表面活性剂、IPM为油相,m(混合表面活性剂)∶m(油相)=9∶1,Km=6∶5时,所形成的纳米乳澄清均一,体系稳定,长期保存不会发生破乳、分层现象,这可能是由于在此质量比范围内,表面活性剂和助表面活性剂、混合表面活性剂和油相之间能更好地增加界面膜的流动性和形成较低的超低界面张力,导致形成粒径较小、界面膜稳定的纳米乳体系。无水乙醇和1,2-丙二醇以质量比3∶2混合作为助表面活性剂,不但可提高纳米乳载体对替米考星的载药量,而且1,2-丙二醇具有防腐和降低凝固点的作用,这样更有利于纳米乳体系的低温保存和稳定。4纳米乳的表征以替米