核甘酸增强乙型肝炎的免疫反应

核甘酸增强乙型肝炎的免疫反应

肝炎病毒具有很高的发病率和高危害。目前，缺乏有效的长期治疗方法。近年研究表明乙型肝炎病毒感染后病毒的清除主要靠细胞毒性T细胞(CTL)及其与非特异性炎症细胞所释放的细胞因子。HBV感染后,如果CTL反应强而有效,则病毒被清除;如果免疫力不足,病毒持续存在将形成慢性。如能激发有效的细胞免疫反应,就可能清除HBV。近年发现,一些非甲基化的脱氧核苷酸片段(ODN),能增加DNA疫苗和多肽疫苗的免疫效果,以细胞免疫反应尤为明显,因此称之为免疫刺激序列(ISS)。实验表明ISS在体外能促使T、B细胞增殖、分裂,诱导抗原递逞细胞释放干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、白细胞介素(IL)-12、IL-18、IL-6等。与蛋白抗原或DNA疫苗混合注射后,能明显加强体液免疫反应和细胞免疫反应。本研究用合成的全硫代修饰的富含C、G碱基的核甘酸(CpGODN)作为佐剂与HBsAg及商用乙肝疫苗混合免疫小鼠,研究其对HBsAg免疫反应的作用,结果如下。材料和方法一、材料表面1.动物C57小鼠8～12周,体重18～22g,购于中山医科大学实验动物中心。2.tcctg-agctctgatctt35′TCCATG-ACGTTCCTGATGCT3′,对照序列:5′TCCATG-AGCTTCCTGATGCT3′。HBsAg(adw亚型),商用乙肝疫苗(adw亚型),规格5μg/0.5ml,卫生部北京生物制品研究所产品。3.ityassay乳酸脱氢酶试剂盒Cytotox96Non-RadioactiveCytotoxicityAssay乳酸脱氢酶试剂盒,购于Promega公司。MitomycinC,Sigma公司;质粒大量提取试剂盒,Qiagen公司。1640(无酚红),用于培养脾细胞及靶细胞,购于GIBCOBRL公司。4.hbsag的特定靶细胞h-2b限制：见文献二、方法1.溶解cpgovd用适量TE(pH8.0)溶解,然后与HBsAg或商用乙肝疫苗按一定比例混合。2.小鼠肝肝疫苗hbsag亚型pg实验分成4组:A组:单纯HBsAg(指乙型肝炎表面抗原纯蛋白,不含任何佐剂),7只小鼠;B组:HBsAg+CpG,10只小鼠;C组:商用乙肝疫苗(与HBsAg亚型相同),6只小鼠;D组:商用乙肝疫苗+CpGODN,10只小鼠。HBsAg及商用乙肝疫苗用量为1.67μg/次,CpGODN为16.5μg/次。采用两剂免疫方案,间隔15d,末次免疫后15d,取血测抗-HBs;取脾细胞作细胞毒性T细胞实验,具体方法见文献。三、统计方法计量资料用算术平均值表示。两组间均值比较采用t检验,多组间比较采用方差分析。结果一、小鼠肝神经损伤的检测加强免疫后15d,单纯HBsAg组小鼠抗体反应阳性率低,其平均A值仅为0.109,接近临界值。乙肝疫苗组仅1只小鼠为阴性,其平均A值为0.422。HBsAg+CpGODN组的A值为0.435,与乙肝疫苗组相似。乙肝疫苗+CpGODN组的A值为0.575,为4组中最高,见表1(检测波长450nm,Cutoff值>0.1为阳性)。对照序列对各组免疫反应的影响无统计学意义,结果未列出。二、sag+cpgond组各组免疫后细胞免疫反应如表2,HBsAg+CpGODN组最高,单纯HBsAg组几乎没有细胞免疫反应,HBsAg组其值也较低,为8.5%。cpgocd与铝剂的协同作用目前使用的乙型肝炎多肽疫苗,对于预防乙型肝炎病毒感染具有较好的效果。在一些发达地区,实施了正规的免疫方案,明显降低了乙型肝炎病毒表面抗原携带率,比如在北京、上海主城区HBsAg携带率已降到1%以下。乙型肝炎病毒感染人体后,同时激发体液免疫和细胞免疫反应。前者主要阻止病毒入侵,而后者主要清除细胞内存在的病毒。如果机体免疫力不足,不能产生有效的细胞免疫反应就不能清除病毒,将形成慢性过程。常规使用的乙肝疫苗,因其免疫原性弱,在制备时加入了铝剂。铝剂75年前就用于人体治疗,是目前惟一用于人体疫苗的佐剂。但铝剂主要诱导2型辅助性T淋巴细胞(Th2)类反应(即抗体反应),对Th1类反应有干扰作用。用含铝剂的HBsAg免疫小鼠,发现铝选择性抑制CD+8CTL产生,而且多价疫苗及减毒疫苗不能与铝剂混用。因此铝剂要用于需要细胞免疫反应的疫苗是不行的。免疫刺激序列(CpGODN)能诱导95%以上的B细胞增生,并分泌多克隆的免疫球蛋白,同时也能活化单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞,使它们释放高水平的IFNγ、IL-12、IL-2等Th1类细胞因子,激发有效的细胞免疫反应。本研究发现单纯HBsAg免疫小鼠后,仅出现微弱的抗体反应,其A值在临界值附近波动,细胞免疫反应亦较弱;在同样的剂量下加入CpGODN,抗体值及细胞免疫反应均明显升高,说明CpGODN作为佐剂有明显的免疫增强作用。单独的疫苗(含有铝剂)诱导出较高的抗体反应,平均A值为0.422,但几乎未测到细胞免疫反应。在疫苗+CpGODN组,抗体值最高,为0.575。而且诱导了较高的细胞免疫反应,提示CpGODN与铝剂有协同作用,并且可克服铝剂对细胞免疫反应的抑制。在小鼠体内的实验证实,CpGODN能增强小鼠对破伤风疫苗的抗体反应。在流感病毒蛋白抗原或灭活亚单位疫苗中加入CpGDNA,能激发抗原特异性的Th1类反应。用重组HBsAg免疫小鼠发现CpGODN能将抗体水平提高5倍,与铝剂有协同作用,两者合用,使抗-HBs提高35倍,并且能诱导强而有效的CTL反应,即使有铝存在也如此。新近在猴子和黑猩猩体内的实验也发现,CpGODN明显增加HBsAg免疫的阳性率和抗体滴度,效果最明显的ODN为ODN1968(5′TCGTCGCTGTTG-TCGTTTCTT3′),ODN2006(5′TCGTCGTTTTGT-CGTTTTGTCGTT3′),ODN2007(5′TCGTCGTTG-TCGTTTTGTCGTT3′)。这些研究表明CpGODN是很有