氨基糖苷类药物抗生素的抗菌特性及结构特点

氨基糖苷类药物抗生素的抗菌特性及结构特点

1氨基糖苷类抗生素1944年，wakmayaan等人报道了链霉菌产生的链霉菌素，报告了3000多种天然和半合成氨基糖苷类抗生素，其中微生物生产的天然氨基糖苷类抗生素近200种。氨基糖苷类(aminoglycosides)抗生素是临床上重要的一类抗感染药物,具有水溶性好、化学性质稳定、抗菌谱广、抗菌能力强和吸收排泄良好等特点,虽然近年受到β内酰胺类和喹诺酮类抗感染药物的挑战,但仍是治疗G菌和结核杆菌感染的首选药物之一。对某些革兰氏阳性菌也有良好的杀菌作用。与青霉素类或头孢菌素类合用,常可取得协同作用。其杀菌活力在一定范围内为浓度依赖性,并具有明显的抗生素后效应(PAE)。根据氨基糖苷类抗生素的抗菌特性及结构特点,此类抗生素可分为3个发展阶段。以卡那霉素为代表的第一代氨基糖苷类抗生素,其品种还有新霉素、巴龙霉素、链霉素和核糖霉素等,其结构特点是完全羟基化的氨基糖与氨基环醇相结合,不抗绿脓杆菌,除链霉素、新霉素外,均已少用;第二代以庆大霉素为代表,其结构中均含有脱氧氨基糖并具有抗绿脓杆菌的特点,其他品种还有妥布霉素、西索米星和小诺霉素等;第三代则是氨基环醇上氮位取代衍生物,品种有阿米卡星、阿贝卡星、奈替米星、阿司米星和我国创新的一类新药依替米星等,其特点是保留了母体的抗菌活性,耳肾毒性小,抗耐药性等。根据氨基糖数目分为假三糖类和假二糖类,氨基含量越多,抗菌能力越强。2氨基糖苷类药物的药敏作用耐酶品种:细菌所产的乙酰转移酶、磷酸转移酶和核苷转移梅等氨基糖苷类钝化酶可破坏卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、西酸霉素等,而新品种对钝化酶较稳定,如阿米卡星(armikacin)、奈替米星(netilmicin)、依替米星(etimicin)和异帕米星(isepamicin),均主要用于耐庆大霉素菌株,即产氨基糖苷类钝化酶菌株的感染。阿米卡星的抗菌谱与庆大霉素相似,其抗菌活性优于卡那霉素,稍次于庆大霉素,特点是对许多肠道革兰阴性菌和铜绿假单胞菌所产的氨基糖苷类钝化酶相当稳定,故对耐庆大霉素菌株所致感染可获良效,而对庆大霉素敏感株所致感染仍应选用庆大霉素;阿米卡星的耳、肾毒性与庆大霉素无明显差别。奈替米星的抗菌作用与庆大霉素相似,对各种氨基糖苷类钝化酶较稳定,稍次于阿米卡星,其耳、肾毒性较庆大霉素稍低,临床也用于较重的革兰阴性杆菌(主要为耐庆大霉素菌株)所致感染。依替米星其分子结构与奈替米星极相似,仅少一双链,故更稳定。对氨基糖苷类钝化酶的稳定性、抗菌作用和耳、肾毒性及其临床疗效均与奈替米星相似。异帕米星的抗菌谱与阿米卡星相似,除铜绿假单胞菌外的大多数革兰阴性菌对异帕米星更敏感。该品对氨基糖苷类钝化酶的稳定性优于阿米卡星;其耳、肾毒性比阿米卡星稍低。主要用于革兰阴性杆菌严重感染,特别是对其它品种包括对阿米卡星耐药菌株所致感染。总体上,耐酶品种以异帕米星为优,其它依次为阿米卡星、奈替米星和依替米星。不耐酶品种:妥布霉素与西索米星(sisomicin)虽然对铜绿假单胞菌的作用优于庆大霉素,但对钝化酶不稳定,故仍用于庆大霉素敏感菌株感染,特别是铜绿假单胞菌感染,而不适用于庆大霉素耐药株所致感染。西索米星的耳、肾毒性较明显,其临床实用价值受到限制。庆大霉素为最常用的品种,为保持其良好的抗菌作用,减缓耐药性产生,不提倡应用口服制剂,更不应擅自局部使用。细菌对卡那霉素的耐药性明显,临床已少用口服制剂用于腹部手术前肠道准备与肝昏迷者。新霉素全身用药毒性明显,口服用于肠道感染与手术肠道准备,局部应用于冲洗伤口与膀胱及脓疖。小诺霉素与核糖霉素作用弱,毒性稍低,仅用于革兰阴性杆菌轻症感染。所有品种均具不同程度的耳、肾毒性。相比之下,对听力损害的发生率依次为卡那霉素(1.6%),阿米卡星(1.5%),西索米星(1.4%),庆大霉素(0.5%),妥布霉素(0.4%);对前庭功能损害的发生率依次为卡那霉素(4.7%),链霉素(3.6%),西索米星(2.9%),庆大霉素(1.2%),妥布霉素(0.4%)。对肾脏的毒性,妥布霉素较庆大霉素低,而庆大霉素、奈替米星、阿米卡星等的肾毒性无明显差异,发生率约10%。对神经肌肉的阻滞作用以新霉素为甚,其次为链霉素>卡那霉素或阿米卡星>庆大霉素或妥布霉素。3微生物效价法正是由于氨基糖苷类的结构和临床应用特点,为了科学合理、安全有效地使用这类抗生素,AGs的定量和痕量分析受到了临床医学和药物分析工作者的重视,特别是对有关物质的分析更是近年来的热点。由于氨基糖苷类抗生素绝大多数无特征的紫外吸收,因此微生物效价法是当前各国药典测定该类抗生素含量的主要方法。同时,微生物法检测成本相对低廉,适于推广使用。但微生物法测定的是总效价,不能分别测定主成分和相关组分或有关物质的量,不能准确反应氨基糖苷类抗生素的内在质量,且影响因素复杂,操作费时。例如王明娟等报道,国内硫酸阿米卡星注射液不同生产厂产品间的杂质A的含量可在0.5%～13%不等,但杂质A具有抗菌活性,所以微生物效价测定时反映不出产品间的质量差别。随着对抗生素结构及其物理化学性质的进一步了解,对于含有抗菌活性的杂质或多组分的抗生素,辅以控制组分级杂质的方法,以弥补效价法测定含量专属性不强的缺点,达到监控药品质量的目的。现介绍目前已应用于氨基糖苷类抗生素质量控制的几种方法。3.1高效薄层色谱法薄层色谱法操作简单,耗时短,所需设备价廉,在氨基糖苷类抗生素的鉴别及有关物质检查中占有主要地位,《中国药典》2005年版收载的12种氨基糖苷类抗生素中有8种采用薄层色谱鉴别方法。氨基糖苷类抗生素为极性较强的碱性化合物,在使用硅胶作薄层色谱的固定相时,展开剂中需要加入氨水调节pH值以减少拖尾现象。由于其结构中具有伯氨基,显色剂中多含有与伯氨基发生显色反应的茚三酮。扫描密度计与TLC技术相结合产生的高效薄层色谱法(HPTLC)因其灵敏度、分离度和准确度都有很大提高,已用于药物定量分析。Funk等用HPTLC测定了新霉素中3个组分新霉素A、B和C的百分含量。有报道应用高效薄层色谱-光度测定法进行兽用制剂中大观霉素的鉴别及定量分析,检测波长421nm,回收率102.54%。TLC-微生物显影技术可检测经分离的杂质是否有抗菌活性,常用于抗生素新品种开发、菌种筛选和质量研究。陈剑峰等报告采用短小芽孢杆菌为生物显影检定菌,双层琼脂扩散法于37℃培养16～18h,通过对培养基pH值、发酵液样品pH值、展开剂、薄板和菌层接触时间等分析条件的优化,测定发酵液中西索米星的效价,方法准确性及稳定性均符合定量分析的要求。TLC具有使用范围广,样品预处理简单,优化展开剂的组成方便等优点,随着吸附剂高效化,定量分析仪器化、自动化,TLC仍然是不可替代的一种用于氨基糖苷类抗生素质量分析的方法。3.2高效液铬hplc法由于氨基糖苷类抗生素没有特征的紫外吸收,采用通常的UV检测器检测较困难,故该类药物的HPLC法以衍生化与非衍生化法为主。3.2.1柱前衍生化法衍生化方法可分为柱前衍生和柱后衍生两种,采用的衍生化试剂有邻苯二醛(OPA)、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS),异氰酸苯酯(PIC),3,5-二硝基苯甲酰氯(DNBCL)(以上用紫外检测器)和氯甲酸芴甲酯(FMOC-CL)(用荧光检测器)等。利用氨基糖苷类抗生素结构中的活泼基团(如氨基、羰基)与衍生化试剂形成紫外区有吸收或有荧光的物质,以便于紫外检测或荧光检测。柱前衍生化方法较简单,不需要特殊的设备;柱后衍生化采用在线技术,便于自动化测定,但需要有特殊的衍生化反应装置,因此柱前衍生化方法较多被采用。由于衍生化法供试品制备步骤繁琐,色谱条件多选用含盐较多的流动相,必要时需加入离子对试剂,长期应用有损色谱柱及进样器的使用寿命;同时影响试验结果因素较多,重现性差。因此,非衍生化方法的开发则更具有实用价值。3.2.2检测方法的选择氨基糖苷类抗生素的非衍生化分析通常采用了新的检测技术:如示差折光检测法、UV末端吸收法、间接测定法、脉冲电化学检测器法、质谱检测法和蒸发光散射检测法(ELSD)等。新型检测器的使用扩大了HPLC非衍生化方法在氨基糖苷类抗生素中的应用,相比之下,各有特点。示差折光检测器受温度和流动相组成影响大,色谱系统平衡需较长时间,已较少采用;UV末端吸收法对仪器及试剂色谱纯度要求高;间接测定法要选用适宜的有紫外吸收或荧光的物质作检测剂,方法不易建立;脉冲电化学检测器灵敏度较高,但采用的多为聚苯乙烯～二乙烯苯色谱柱,实验条件苛刻,通用性差;质谱检测器灵敏度高,但仪器昂贵。近年来,在药学领域中广泛应用的蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型质量检测器,对任何挥发性低于流动相的样品均能被检测,并且在一定条件下物理性质相似的物质其响应因子基本一致,可以满足样品有关物质检查和含量测定等多项药物质量控制的要求,专属性强、灵敏度高,在氨基糖苷类抗生素的分析中占有重要的地位。3.3基于gc-ms法的化合物衍生化氨基糖苷类抗生素不具挥发性,需要提高温度用硅烷化试剂衍生化后进行GC分析。《USP》26版、《BP》2002年版中盐酸大观霉素的测定即采用六甲基硅烷衍生化后FID检测。PreuM等报道了一个两步衍生化测定生物材料中庆大霉素和卡那霉素的方法,用三甲基硅烷咪唑(TMSI)对羟基进行三甲基硅烷化和用N-(heptafluorobutyryl)-imidazole(HFBI)对氨基进行酰化,衍生化产物在经液液萃取后用毛细管GC-MS法分析,庆大霉素可分离出C1、Cla和C23种成分,方法灵敏,可测定30～200μg的庆大霉素和10～200μg的卡那霉素。GC-MS是所有联用技术中发展最完善,应用最广泛的方法。3.4氨基糖苷类保水性计算方法flurercl-3-古代酸盐缓冲系统图10毛细管电泳是上世纪80年代后期发展起来的一种分离分析技术,HPCE是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相色谱分离技术。根据分离模式的不同,又可分为毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管凝胶电泳(CEC),胶束电动毛细管色谱(MEKC)等,具有分离效率高、速度快、样品用量少的特点。FlurercL介绍了采用硼酸盐缓冲系统(pH为9)为电解质,阴极端(在检测器边)UV195nm波长下直接测定,12种氨基糖苷类抗生素及其杂质(庆大霉素C、庆大霉素Cla、庆大霉素C2+C2a、西索米星、地贝卡星、链霉素、双氢链霉素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素B、卡那霉素A、巴龙霉素、布替罗星A、布替罗星B、核糖霉素)可被有效分离。本方法有良好的精密度(RSD=3%),定量限在50μg·mL-1。AckermansMT等采用间接测定法检测,在缓冲液中加入一定量的有紫外吸收的咪唑为背景电解质,当无紫外吸收的样品分子通过检测器时,出现倒峰而检测。在0.01mol·L-1咪唑背景电解质中,214nm检测,成功分析了6种氨基糖苷类抗生素。电化学检测器同样适用于CZE技术,此法可同时检测7种氨基糖苷类抗生素。此类抗生素的HPCE检测方法,最为常用的仍然是柱前及柱内衍生的CZE技术,然后进行紫外检测。3.5电性离子检测电喷雾离子阱多级质谱法(ESI-MS)技术属于软电离方式,可在温和的条件下获得待测物的准分子离子峰。氨基糖昔类化合物在结构中含有多个伯胺或仲胺基团显弱碱性,在质谱上具有较强的正离子响应。ESI-MS已成功地用于链霉素、双氢链霉素、巴龙霉素、核糖霉素、阿米卡星,妥布霉素、卡那霉素A、新霉素和威替米星等的定性分析以及庆大霉素和新霉素的定量分析。ESI-MS法不需要标准品即可对混合物中除同分异构体外的各组分进行定性和半定量分析,方法准确、快速、简便。由于这类药物在结构和理化性质上非常相似,用一般的方法进行快速鉴别存在一定的困难。但用ESI-MS法可迅速得到其单一组分或多组分(如庆大霉素)的多级质谱信息。这对该类化合物的定性鉴别和定量分析以及有关物质的检测提供了可靠的理论依据,对严格控制药品的质量有很好的指导作用。3.6原子吸收光谱法ass法免疫分析是近年来发展很快的一种方法,已用于生物样本中微量抗生素的快速鉴别。原子吸收光谱法(ASS)方法用于庆大霉注射液的测定,回收率在98.6%～103.0%之间。另外还有一些非专属性的理化测定方法(旋光法、分光法、容量法、量热法)的报道,主要用于制剂生产过程中的质量控制和溶出度研究。4氨基糖苷类物质元素检测氨基糖苷类抗生素有关物质主要为合成前体、异构化产物、其它副产物和储存期降解物,其结构与主成分较为相似。故能用于测量氨基糖苷类抗生素含量的灵敏度高、专属性强的方法,基本都可用于其有关物质的检测。基于检测方法的实用性和普及性,目前国内制药行业用