液相色谱-串联质谱法测定人血浆中洛匹那韦、利托那韦

液相色谱-串联质谱法测定人血浆中洛匹那韦、利托那韦

最近销售的kaletra是ropenavor，lpv）和ropenavir（rtv）的复合制剂。洛普内韦和利托内韦是经f（r）批准上市的hiv酶抑制剂。蛋白酶抑制剂是高效抗逆转录病毒疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)的重要组成部分,其中洛匹那韦为新一代HIV蛋白酶抑制剂,其抗病毒活性比利托那韦强10倍,而毒副作用明显降低。少量的利托那韦通过抑制细胞色素P450CYP3A酶降低对洛匹那韦的代谢,可显著增强洛匹那韦的血药浓度,从而提高其抗HIV-1的作用。由于血药浓度与疗效、毒副作用密切相关,目前国内尚未报道洛匹那韦和利托那韦的血药浓度测定方法,本研究旨在建立一种选择性好、灵敏度高的高效液相串联质谱法,同时测定血浆中洛匹那韦和利托那韦的血药浓度,为临床药代动力学、治疗药物浓度监测、生物利用度等研究奠定基础,从而指导临床用药,及时调整用药方案以预防不良反应发生。柱、柱、相、液、液的提取高效液相色谱仪(包括DGU-20A3型在线脱气系统,LC-20AD型二元泵,SIL-HTC型自动进样器,CTO-20AC型柱温箱),日本SHIMADZU公司;API3200三重串联四极杆质谱仪,电喷雾电离源(ESI)以及Analyst1.4.1数据处理系统,美国AppliedBiosystems公司;Eppendorf5415R低温高速离心机,德国艾本德公司产品;TECHNE氮吹仪,英国TECHNE公司产品。洛匹那韦(纯度为98%,100mg,批号20080801)由PIChemicals公司提供;利托那韦(80mg,批号002VK3)由EUPharmacopeia(EUDP)提供;内标替米沙坦(纯度为99.5%,批号:040511)由北京柏雅方舟医药科技有限公司研发;Kaletra胶囊(含洛匹那韦200mg,利托那韦50mg/片,批号65021VA)由美国雅培公司提供;乙腈和甲醇均为Merck公司的色谱纯试剂。色谱柱EclipseXDB-C18(150mm×4.6mmID,5μm)和预柱C18柱(12.5mm×4.6mmID,5μm),美国Agilent公司;流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇(20∶80);流速为0.5mL·min-1;柱温35℃,分析时间为每个样品12min,流动相用0.45µm滤膜过滤。进样量为10μL,采用自动进样方式。电喷雾电离(ESI),采用正电荷检测模式。离子源条件为温度:500℃;源喷射电压:4500V;气帘气压:35psi(1psi≈6.9kPa);CAD:3psi;Gas1:70psi;Gas2:50psi。扫描方式为多反应监测(MRM),用于定量反应的离子反应分别为m/z629.6→155.2(洛匹那韦),m/z721.4→268.2(利托那韦)和m/z515.2→276.2(内标替米沙坦),扫描时间200ms碰撞能量依次为55eV(洛匹那韦)、45eV(利托那韦)和60eV(替米沙坦)。分析物和内标用甲醇配成1.0mg·mL-1的贮备液,于-20℃保存。对照品贮备液配制:将1.0mg·mL-1贮备液用50%甲醇配成洛匹那韦质量浓度为0.625、0.8、6.25、8、12.5、25、50、80和100µg·mL-1,利托那韦质量浓度为0.125、0.15、1.25、1.5、2.5、5、10、15和20µg·mL-1的混合贮备液。内标贮备液为100ng·mL-1。精密移取血浆100µL,置于1.5mL离心管中,精密加入100ng·mL-1内标液10µL,有机溶剂A(50mmol·L-1醋酸铵-乙腈,1∶6)200µL,涡流混合3min,再加入乙酸乙酯1mL,涡流混合5min,4℃、12000r·min-1高速离心10min,吸取上清液(乙酸乙酯层)至另一支1.5mL离心管中,37℃氮气吹干,下层溶液用乙酸乙酯1mL按上述方法再提取1次,上清液吸至相应离心管中,氮气吹干,残渣用流动相200µL复溶,涡流混合,取上清液10μL进行LC-MS/MS分析。临床试验在上海市公共卫生临床中心进行。试验方案在受试者签署知情同意书后,经独立伦理委员会批准,每次给予Kaletra两粒(含洛匹那韦400mg+利托那韦100mg),一天两次。2天后待达到稳态血药浓度后,取正在服用Kaletra药物治疗的HIV感染者上肢静脉血2mL,用EDTA抗凝管收集并立即离心10min(2000r·min-1),分离血浆,冷冻保存(-80℃)至待测。临床实际血浆样品测定按“血浆样品处理”方法项下操作,每天建立1条标准曲线,同时制备低、中、高(多样本)浓度的质控样品,根据当日标准曲线求算未知临床样品浓度和QC样品浓度,决定当日数据取舍。至少67%QC样品的相对偏差在±15%内,且33%的不是同一浓度的QC样品相对偏差可以超出±15%,当日数据方可接受。浓度超过定量上限的血浆样品,将样品以空白血浆稀释后重新测定。结果1m/z比例在选定的质谱条件下,洛匹那韦、利托那韦和内标替米沙坦主要生成[M+H]+准分子离子峰,分别为m/z629.6、721.4和515.2。选择性对[M+H]+进行MS2产物离子全扫描质谱分析(图1),洛匹那韦、利托那韦和内标替米沙坦的主要碎片离子分别为m/z155.2、268.2和276.2,将其作为多反应监测(MRM)扫描时监测的产物离子。2方法研究2.1峰的分辨率和内源性杂质分别取6名受试者空白血浆考察方法的选择性,结果表明各样品峰具有很好的分辨率,内源性杂质无干扰,内标响应稳定。空白血浆、空白血浆加洛匹那韦和利托那韦和内标替米沙坦对照溶液、及艾滋病患者口服Kaletra的血浆样品色谱图,见图2。2.2回归方程和检测限取空白血浆100μL,加入洛匹那韦和利托那韦混合对照系列溶液20μL,配制成相当于洛匹那韦血浆质量浓度为0.0625、0.625、1.25、2.5、5和10μg·mL-1及利托那韦血浆质量浓度为12.5、125、250、500、1000和2000ng·mL-1的样品,按“血浆样品处理”项下依法操作,每一浓度进行双样本分析,进样10μL,记录色谱图;以待测物浓度(X)为横坐标,待测物与内标物的峰面积(Y)比值为纵坐标,用加权最小二乘法(w=1/x2)进行回归运算,得洛匹那韦和利托那韦的标准曲线。洛匹那韦的典型回归方程为Y1=4.12×10-4X1+3.24×10-3(r=0.9952),利托那韦为Y2=4.99×10-4X2-3.63×10-4(r=0.9985)。灵敏度试验中的定量限(LOQ)采用质谱分析时信噪比大于等于10,在3次独立实验中测量值与理论值的标准偏差小于20%。LPV和RTV的LOQ分别为50和15pg·mL-1。检测限(LOD)采用质谱分析时信号与噪音的比值大于等于3,LPV和RTV的LOQ分别为15和8pg·mL-1。说明该方法具有很好的灵敏度。2.3精密度和准确度取空白血浆100μL,按照“标准曲线和灵敏度”项下方法配制成低、中、高(洛匹那韦质量浓度分别为80、800和8000ng·mL-1,利托那韦质量浓度分别为15、150和1500ng·mL-1)3个浓度的(QC)样品,每一浓度进行5样本分析,连续测定3天,根据当日的标准曲线,计算QC样品测得的浓度进行方差分析,得到日内和日间精密度,结果见表1。2.4提取回收率及样品稳定性考察了洛匹那韦和利托那韦低、中、高3个浓度下的提取回收率(n=5),以各待测物血浆样品按“血浆样品处理”提取后的色谱峰面积,与空白血浆提取后再加入相应浓度的洛匹那韦、利托那韦和内标溶液获得的色谱峰面积之比,计算回收率。洛匹那韦低、中、高3个浓度的提取回收率分别为79.7%、76.1%和82.2%,利托那韦低、中、高浓度的提取回收率分别为87.5%、75.7%和81.6%,内标的提取回收率为81.0%。取志愿者空白血浆100μL,按“血浆样品处理”项下处理,加入洛匹那韦和利托那韦低、中、高3个浓度20μL,内标20μL,进行LC-MS/MS分析获得峰面积,与混合溶液直接进样获得峰面积之比评价基质效应,比值均在90%~115%,表明本方法可有效地避免人血浆基质效应。考察了洛匹那韦、利托那韦低、中、高3个浓度的血浆样品在不同保存条件下的稳定性(n=3)。结果表明,洛匹那韦、利托那韦血浆样品室温放置6h稳定(洛匹那韦RE为-7.0%~-1.7%,利托那韦RE为-4.6%~-4.1%)。血浆样品经历3次冷冻解冻循环稳定(洛匹那韦RE为-13.5%~4.5%,利托那韦RE在-10.0%~7.4%),血浆样品-80℃保存1个月稳定(洛匹那韦RE在-8.5%~4.2%,利托那韦RE在-7.0%~3.7%)。3临床样品检测用建立的方法分析5个HIV患者服用Kaletra药物达到稳态浓度的血浆临床样品,结果显示,该方法能检测到待分析物浓度,适用于临床治疗药物浓度监测(表2)。数据分析和监测响应目前已有国外文献报道LC-MS/MS法测定Kaletra给药后生物样品中洛匹那韦和利托那韦的药物浓度。Yadav等使用ESI电离源,在正离子检测方式下选择洛匹那韦m/z629.3→447.4,利托那韦m/z721.3→296.3,作为定量分析时监测的产物离子;Jung等则采用APCI电离源,在正离子检测方式下,选择洛匹那韦m/z629.4→447.3,利托那韦m/z721.3→268.1。本实验考察了正负离子检测模式,发现洛匹那韦和利托那韦在正离子模式下有较好的响应,而且在CAD为3的条件下洛匹那韦主要生成碎片离子155.2,利托那韦主要生成碎片离子268.2,洛匹那韦的碎片离子与文献报道不同,可能是CAD较大,母离子易裂解,因此在本实验条件下用于定量反应的离子反应分别为m/z629.6→155.2(洛匹那韦),m/z721.4→268.2(利托那韦),MRM监测响应较强且稳定。文献报道的样品预处理方法有固相萃取法,但是SPE固相萃取成本太高、耗时。Wang等采用正己烷-乙酸乙酯(1∶1)萃取;Estrela等