盐胁迫下野生大豆的耐盐碱性鉴定

盐胁迫下野生大豆的耐盐碱性鉴定

在世界自然灾害严重影响植物生长和繁殖的背景下，植物抗逆性研究尤为重要。野生大豆是栽培大豆的近缘植物,在野外生活能力强,适应性广泛,近年来其优良抗逆特性已普遍被众多学者重视,用来为遗传狭窄的栽培大豆提供优异的基因资源。多年研究表明,植物对盐离子的过量吸收会导致一些营养元素的吸收受到抑制,如Na+过多会影响植株对K+、Ca2+、Mg2+等的吸收,Cl–和SO42–吸收过多可降低对HPO4–的吸收,从而引起作物缺素,影响作物的营养和生殖生长,主要表现在生理干旱、单盐毒害、营养失衡和生理代谢紊乱等方面。作物在逆境条件下能够自我调整,主要通过降低无机离子等盐类在体内的积累而避免盐类的危害,或通过生理代谢的适应性而忍受已进入细胞的盐类。同时可伴随离子区域化,渗透调节物质积累作用,维持膜系统完整性等多机制交互作用实现植物盐碱环境中的适应性。野生大豆耐盐碱性与离子摄入和区域化、小分子渗透物质积累合成、大分子蛋白的合成以及基因表达等有关。野生大豆盐害机理研究方面,就离子效应而言,Abel和Mackenzie指出Cl–更容易对大豆产生危害,而Luo等认为Na+比Cl–对野生大豆更具有毒性。前人已广泛开展大豆、小麦和高粱等重要作物的耐盐碱性研究,并确定了这些作物的耐盐阈值,而野生大豆这方面研究比较匮乏,且众多学者的研究,只局限于单一盐碱溶液形式胁迫对出苗率和苗期生长的影响,无法给出植株生命周期内的耐盐碱表现。本文在天津地区3%高盐碱含量土壤上,对野生大豆整个生育期内受害凋亡和成熟收获时的耐盐碱性鉴定评价,旨在明确野生大豆植株凋亡时茎叶中无机离子(Na+、Cl–、K+、Ca2+、Mg2+)的累积程度及其耐盐范围,并分析其耐盐碱性差异原因,初步探讨野生大豆的耐盐碱适应性机制,为今后充分开发利用野生大豆耐盐碱性资源提供参考和依据。1材料和方法1.1野生大豆单株采集2006年在渤海湾的天津和唐山沿海地带采集895份野生大豆单株。收集地土壤生态环境均为不同程度盐碱或干旱土壤,个别材料生长在小生境条件好的土壤上。1.2耐盐材料对大豆种植的影响试验土壤取自天津海滨的海水人工养殖池的池埂咸土,土壤总盐碱含量为3%(称重法),pH7.8。取土点及周围没有任何野生大豆分布。试验设置3个处理,处理I为全盐碱土盆栽直接播种(塑料盆直径35cm,高30cm,每盆装12kg盐碱土,下面垫有托盘),处理II为非盐碱土覆盖补种盆栽。全盐碱土直接播种14d后没有出苗的株系,可能由于其对盐碱土十分敏感,采用大田土壤覆盖(非盐碱)补种。处理III为大田土盆栽对照,在所有盆中均精量播种5粒种子。处理I和处理III为5月14日播种。采用滴灌方式浇水,根据盆的湿度情况每周滴灌1~2次。以耐盐材料栽培大豆铁丰8号和文丰7号为对照。2007年在中国农业科学院作物科学研究所网室内全生育期鉴定895份材料。播种后在盐碱胁迫下有692份材料未发芽或凋亡时生物产量未达到测量所需的最小量,共测定203株野生大豆植株茎、叶中Na+、Cl–、K+、Ca2+、Mg2+的含量,其中包括未活到果实成熟的凋亡株97株(处理I89株,处理II8株),最终成熟收获株106株(处理I83株,处理II23株)。铁丰8号播种5粒种子2粒出苗,文丰7号3粒出苗,在播种后1个月内相继凋亡。1.3x射线荧光ssp法将样品在120℃下烘6h后称其干物质重(烘干法),用粉碎机(DFT-50手提式)将植株的茎和叶分别粉碎,干燥后以7份茎叶混合样制定标准曲线,用布鲁克公司X射线荧光光谱仪(S4PIONEER波长色散型)测定Na+、Cl–、K+、Ca2+、Mg2+含量,含量单位用%表示,为干重相对量。测定前用7份地上部混合样制定标准曲线。1.4耐盐碱差异原因分析我们在先前的研究中采用隶属函数法综合材料6个主要产量相关性状对耐盐碱型野生大豆进行耐盐碱性评价鉴定,本研究对隶属函数值(D值)高低材料组体内Na+、Cl–、K+、Ca2+、Mg2+含量进行分析,解析野生大豆耐盐碱差异的原因。以203株野生大豆植株茎、叶Na+、Cl–、K+、Ca2+、Mg2+含量,结合野生大豆植株存活时间(播种到凋亡的天数),将其分为8组,分别计算每组植株体内各离子含量(1:≤50d;2:51~65d;3:66~80d;481~95d;5:96~110d;6:111~125d;7:126~140d;8≥141d)。利用SPSS16.0ForWindows软件及Duncan多重比较法对所得数据进行统计分析。2结果与分析2.1野生大豆碱中毒的植物茎、叶片na、cl-、k、ca2、mg2的含量2.1.1植物叶片中na+和cl–含量图1-A显示盐碱胁迫下凋亡的野生大豆植株Na+平均含量积累为茎>叶,高盐碱胁迫(处理I)与苗期减轻盐碱胁迫(处理II)对存活时间不同组的凋亡植株茎中Na+含量影响均未达显著水平,且在各自处理条件下,同一时间范围内凋亡的植株茎中Na+含量差异不显著。渗透胁迫是植物体产生盐害的重要原因之一,Cl–是渗透胁迫的重要参与者。非盐生植物常常通过提高自身体内盐分的浓度来提高渗透压,从而导致Na+和Cl–盐害。图1-B反应了2种方式处理下不同存活时间范围内的野生大豆植株茎、叶Cl–含量的分布,植株茎、叶Cl–含量与其对应的Na+含量在各个存活时间段内不同处理间均表现一致。从凋亡植株茎、叶的离子含量分析可以看出不同存活时间范围内盐碱致死的野生大豆植株中地上部Na+、Cl–含量差异并不显著。野生大豆盐碱致死植株茎、叶内的钠离子或氯离子存在致死量,即达到一定水平时出现凋亡现象,茎中Na+和Cl–致死量范围分别为3.239%~4.682%和4.639%~6.328%叶中分别为1.754%~2.349%和4.126%~5.073%。2.1.2不同生存时间下叶片中ca2+含量的变化K+的吸收通常在氯化钠造成的盐渍环境中尤其重要。表1表明,随着野生大豆在盐碱胁迫条件下存活时间的延长,处理I盐碱致死的植株茎、叶内K+含量均无明显差异,处理II则在存活81~95d(4组)与96~110d(5组)之间,差异分别达显著水平,后一组的植株K+平均含量最高。而叶片中K+含量在各存活时间组间的差异不显著。在处理I和处理II条件下,同一时间范围内凋亡的植株茎、叶中K+含量差异均未达显著水平。Ca2+与Na+在植物的细胞质中存在竞争机制,叶片中Ca2+含量越高越有助于在叶片中滞留较少的Na+,在较高Ca2+含量时,植物组织细胞可发挥正常代谢功能及稳定结构。由表1可以看出,不同处理条件下相同时间段凋亡的野生大豆植株茎、叶Ca2+含量水平差异均不显著;存活时间的长短对处理I野生大豆凋亡植株茎、叶Ca2+含量无显著影响;处理II条件下野生大豆凋亡植株茎中Ca2+含量也分别无显著差异,而叶中情况不同,81~95d(4组)与96~110d(5组)凋亡植株叶中Ca2+含量差异达显著水平,且96~110d(5组)凋亡的植株Ca2+平均含量最高。同时得出不同存活时间段内野生大豆凋亡植株叶片中Ca2+平均含量高于茎中。通过对处理I条件下植株茎、叶Mg2+含量的分析可以看出,前期凋亡植株茎中Mg2+含量高于后期,叶中则为后期高于前期。其中播种后50d内(1组)凋亡的野生大豆植株茎中Mg2+含量显著高于同处理下126~140d(7组)时间范围内凋亡植株茎中Mg2+含量,而前期叶片中Mg2+含量显著低于96~110d(5组)和111~125d(6组)时间段凋亡植株中的Mg2+含量,且除≤50d(1组)凋亡植株茎中Mg2+含量高于叶中外,其他存活时间组内凋亡野生大豆植株Mg2+含量均为叶中高于茎中。在处理II条件下,66~80d(3组)存活范围内受盐害凋亡株叶片Mg2+含量均显著低于96~110d(5组)范围内凋亡的植株叶Mg2+含量,而各存活时间范围内受盐害凋亡株茎中Mg2+含量差异不显著。96~110d(5组)内凋亡的植株茎、叶Mg2+含量均表现最高。2.2野生大豆的成熟植株和成熟植株的茎、叶na、cl-、k、ca2、mg2的含量2.2.1叶片中na+和cl–含量野生大豆播种110d后,既存在植株受害致死情况又有植株正常成熟收获的情况,成熟期不同处理野生大豆盐碱害致死植株与成熟植株间茎、叶植株中Na+和Cl–含量如图2所示。从野生大豆存活时间长短看,2种处理条件下相同时间范围内的野生大豆成熟植株与致死植株茎中Na+含量未见显著差异;不同存活时间组间,相同处理的成熟植株茎中Na+含量差异也不显著,致死植株茎中Na+含量表现一致(图2-A)。2种处理条件下,不同成熟时期收获的野生大豆植株茎、叶中的Cl–含量差异均不显著,致死的野生大豆植株茎和叶间Cl–含量亦无显著性差异(图2-B)。与上述情况不同的是,处理I播种140d后(8组)成熟的野生大豆植株叶中Na+含量显著低于存活时间为111~125d(6组)时间段内处理2盐害凋亡株叶中Na+含量(图2-A)。处理I成熟期收获(8组)的植株地上部Cl–含量显著低于前一期(7组)盐害凋亡的植株地上部中Cl–含量(图2-B)。从图2可以得出,在处理I条件下,存活时间不同的野生大豆植株茎、叶的钠离子和氯离子积累量均低,在盐碱环境中表现出高的耐性,由此可以推断,部分野生大豆株系可以通过排斥吸收钠离子和氯离子来适应高盐碱环境。2.2.2不同生长时期叶片中ca2+和mg2+含量相同存活时间范围内不同处理下,野生大豆植株茎、叶钾离子含量均未达显著水平,相同处理下不同存活时间组间野生大豆植株茎、叶中K+含量均不显著。在处理I条件下,不同成熟时间收获的植株茎、叶中Mg2+含量差异均不显著;最晚成熟的(8组)植株茎、叶Ca2+含量显著高于前期成熟的植株茎、叶中Ca2+含量;在处理II条件下,126~140d存活时间内(7组)晚熟植株叶中Ca2+和Mg2+含量及茎中Ca2+含量均显著高于前一时间段111~125d(6组)成熟野生大豆植株,而≥141d收获的野生大豆植株茎中Mg2+含量显著高于前期成熟的野生大豆植株。从表2可以看出,随着野生大豆存活时间的延长,茎叶中钙离子和镁离子积累量有增加的趋势;部分植株在盐碱胁迫下能够正常成熟,原因可能是在盐碱环境中,耐盐碱性野生大豆能够通过大量吸收钙镁离子来适应逆境的胁迫。2.3不同生长植株茎、叶中na+、ca2+、mg2+含量根据野生大豆盐碱致死植株的茎中Na+含量的平均范围,即3.239%~4.682%,将处理I与处理II成熟收获植株茎中Na+含量划分为3个域,同时计算各域内植株茎、叶中其他离子平均含量并做差异性分析。如表3所示,处理I成熟植株茎中Na+含量均表现出3种含量水平,即:(1)显著低于凋亡植株含量水平;(2)达到平均水平但仍能成熟收获;(3)高于平均水平并且正常成熟收获。Cl–含量也表现与Na+含量同样的差异水平,平均差异显著。从表3还可以看出植株茎、叶Na+含量高的成熟植株茎和叶中Cl–平均水平也高,而K+、Ca2+、Mg2+含量水平情况则相反,即茎、叶积累较高浓度的Na+和Cl–的野生大豆植株的茎、叶相对积累较低浓度的K+、Ca2+、Mg2+。处理II成熟植株茎中Na+、Cl–、K+含量也表现出3种差异,并且差异显著,但叶中Na+、Cl–及Ca2+含量仅表现出两种情况,即含量显著低于凋亡植株平均水平与达到和高于平均水平植株之间差异显著,3种Na+含量范围成熟植株茎中Ca2+、叶中K+和茎叶中Mg2+含量差异均未见显著水平。2.4ca2+、mg2+含量比例的确定产量构成因素是野生大豆全生育期耐盐种质鉴定最重要的评价指标。通过各离子在茎叶中含量比例可判断茎叶分配对植株耐盐性的影响程度及最终对产量的贡献。由图3相关分析可以明显看出,高盐碱胁迫(处理I)与苗期减轻盐碱胁迫(处理II)下产量构成因素(单株粒重,单株粒数与百粒重)均与地上部Na+/Cl–及茎叶中Na+、Cl–、K+含量比例(图3中3~6)呈正相关,与植株茎中和叶中的Na+/Cl–、茎叶中Ca2+、Mg2+含量比例(图3中1~2,7~8)呈负相关。产量构成因素(单株粒重)与茎和叶中K+含量比(r1=0.579**)和Na+含量比(r2=0.795**)正相关程度最高,此次为Cl–含量比(r1=0.398**,r2=0.771**);就负相关程度而言,与茎和叶中Ca2+含量比最大(r1=–0.529**,r2=–0.447*),其次为Mg2+含量比(r1=–0.226*,r2=–0.270)。说明在高盐碱环境中当植株体内离子含量趋于平衡时,叶中转运分配Na+、Cl–、K+含量越低,Ca2+、Mg2+含量越高则越利于植株成熟期产量建成,可见野生大豆对Na+和Cl–的吸收与K+、Ca2+、Mg2+的吸收具有竞争性,植株中茎中K+及叶中Ca2+、Mg2+含量的积累能够减弱Na+、Cl–对植株的毒害。同时,茎叶地上部中Na+/Cl–与产量构成因素的相关关系表明,野生大豆植株经根系从土壤吸收Na+、Cl–转运到地上部,Na+积累越多,Cl–积累越少则越有利于植株完成生活史,当植株体内离子达到一定平衡状态时,植株茎中Na+,叶中Cl–越小对产量建成越有利。经苗期减轻盐碱胁迫环境而成熟的植株与一直处在高盐碱环境中成熟植株比较各产量构成因素与体内Na+、Cl–、K+、Ca2+、Mg2+茎叶含量分配比相关关系的显著性较弱,离子比促进植株产量形成效应更明显。2.5不同株系叶片养分含量耐盐碱性评价鉴定隶属函数法得出的D值越高野生大豆对盐碱的抗性越强。根据D值将耐盐碱型野生大豆划分为高耐型和低耐型,D值较高的前15个株系为高耐型,D值较低的后15个株系为低耐型2种类型的野生大豆单株粒重、单株干重及不同部位各无机离子含量列于表4和表5。从表4和表5可以看出高耐盐碱型野生大豆茎和叶中Na+、Cl–和K+含量比显著高于低耐型野生大豆,而Ca2+和Mg2+之比则显著低于低耐型;高耐型野生大豆的平均单株粒重和单株干重显著高于低耐型;且高耐型野生大豆植株茎中Ca2+、K+含量和叶中Ca2+、Mg2+平均含量显著高于低耐型野生大豆株系,而植株茎、叶Na+和Cl–含量差异与上述情况相反;高耐型和低耐型野生大豆叶K+平均含量和茎Mg2+平均含量均无显著差异。由表4还可以看出高耐性植株体内存在两种毒离子含量水平,一种是Na+和Cl–积累程度很高,H300、H384、与H332茎、叶Na+和Cl–含量明显高于其他株系;另一种是Na+和Cl–积累量很低野生大豆高耐盐株系T754、T37与T49茎、叶Na+和Cl–含量均低于平均含量。茎中Na+含量差异达2.8倍,Cl–含量差异达3.5倍,而叶中Na+含量差异高达5.6倍,Cl–含量差异更甚高达7.0倍,但这些株系均为高耐型株系,通过比较发现这些高耐盐株系的茎叶比都较高,这可能与不同高耐盐型野生大豆株系植株茎、叶存在不同的耐盐机制有关。3讨论3.1盐碱条件下野生大豆的生长特性赵可夫等研究认为盐离子在浓度相当高的情况下才会致害,通过这些离子产生的直接伤害和其渗透胁迫产生的次生伤害发挥作用。本试验中,在高盐碱胁迫条件下,未进入成熟期就盐碱致死的存活时间长短不同的野生大豆植株Na+和Cl–含量无显著差异,说明在野生大豆体内Na+和Cl–存在致死量,即当其积累达到一定水平时,植株才出现凋亡现象。然而成熟期收获的部分野生大豆株系在体内的危害离子含量较高时,并没有出现凋亡现象,由此可以看出,耐盐碱型的野生大豆株系在盐碱条件下可以忍耐危害离子对其自身的伤害,其体内可能有特殊的免受盐碱离子毒害或者有自我修复功能,表明耐盐碱的野生大豆能够通过长期的适应环境变化逐步形成抵御不良环境的机制。在我们以前的研究中,通过观察盐碱条件下野生大豆的形态指标,利用耐盐碱性评价鉴定隶属函数法得出的D值,作为筛选耐盐碱性株系的标准,D值高者,各产量性状综合表现优良,为高耐型株系。本研究结果显示,即使在全生育期鉴定获得的耐盐碱株系中,根据地上部形态、产量性状鉴定评价的耐盐碱程度D值高的株系中,也存在Na+和Cl–含量差异,D值较高的前15个野生大豆株系茎中Na+和Cl–平均含量为2.69%和4.05%,叶中Na+和Cl–平均含量仅为0.40%和1.96%,而D值较低的后15个野生大豆株系茎中Na+和Cl–平均含量分别为4.21%和5.55%,叶中Na+和Cl–平均含量为1.70%和4.84%。可以看出,野生大豆在盐碱胁迫下,存活到成熟的野生大豆株系对Na+和Cl–的吸收具有排斥性和忍耐性。3.2离子协同试验K+是保证植物正常代谢和生长发育的大量营养元素,是大多数植物活细胞中含量最高的无机离子,因此也是调节植物细胞渗透势的重要组成部分。刘德玺等研究表明在盐碱条件下,随着树龄的增加,红生理代谢越来越旺盛,K+的需求量不断增加,且地上部分主要富集于叶内。本试验中,野生大豆植株叶片中K+含量普遍相对高于茎,茎中K+含量最低,且高耐型野生大豆植株中茎中K+含量显著高于低耐型,说明野生大豆吸收K离子主要分布在叶片中,但在盐碱胁迫下茎中富集K离子越多,即茎中与叶中K+含量之比越大越有利于植株在盐碱环境中存活。Ca2+和Mg2+作为植物生长发育所需要的重要营养元素,对于维持野生大豆在盐碱胁迫下正常生长发育具有十分重要的作用。Bañuls等在甘桔中研究发现Ca2+能够有效地降低Na+和Cl–从根系向叶片的运输,本试验结果表明,高耐型植株中茎、叶Ca2+含量高,而Na+和Cl–含量较低,可能是植物对钙离子的吸收抑制钠离子和氯离子从根部到地上部植株的运输,从而野生大豆可以在高盐环境下存活并生长良好,Ca2+参与离子协同作用值得关注。本试验中随着植株存活时间的延长,晚受毒害凋亡的野生大豆植株茎和叶中Ca2+和Mg2+的含量呈现升高的趋势尤其以Ca2+增加比较明显。Lauchli基于对盐胁迫下玉米原生质体细胞质中游离Ca2+浓度的测定结果认为盐胁迫下Ca2+可作为一种信使物质在植物对盐胁迫的感受、适应和抵抗中起作用。本试验中高耐盐的野生大豆株系叶片对Na+和Cl–的排斥吸收可能与Ca2+的吸收有关。3.3耐盐碱型植株的盐害机理研究不同作物个体发育不同阶段的耐盐性存在敏感时期,大豆敏感时期在发芽期和立苗期,乔亚科等采用芽期耐盐和田间盐池鉴定方法对河北昌黎沿海野生大豆耐盐性进行评价,发现芽期与成株期野生大豆耐盐性有不完全一致的现象,进行野生大豆耐盐性鉴定仅局限于苗期和芽期难以评价野生大豆材料的综合耐盐程度,本研究显示,通过降低苗期敏感株系耐盐压力后发现部分株系可以成熟收获种子,全生育期盐碱胁迫下野生大豆在各个时间点上均出现凋亡现象,非耐盐碱型野生大豆株系体内达到盐害离子致死量则凋亡,耐盐碱型野生大豆可能存在不同遗传调节机制阻止机体快速达到盐害离子致死量,而最终争取时间完成种子成熟。杨晓英等在苗期耐盐鉴定研究指出,耐盐种群的根系具有积累Na+和Cl–的能力,叶片Na+和Cl–含量较低,而盐敏感种群根系中Na+和Cl–低于耐盐种群,叶片中Na+和Cl–含量高于耐盐种群。相关分析得出,野生大豆对Na+和Cl–的吸收与K+、Ca2+、Mg2+的吸收具有竞争性,植株中茎中K+及叶中Ca2+、Mg2+含量的积累能