金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药性及产酶率分析

金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药性及产酶率分析

20世纪80年代末以来，抗甲氧西林黑细菌（mrsa）第一位进入学院，并在90年代迅速扩张。2002年美国儿科年会报告院外耐药性葡萄球菌感染已70%。因此目前MRSA耐药性及耐药机制的相关研究倍受重视,成为研究热点之一。我们收集我院2003年10月到2004年10月从临床分离得到的金黄色葡萄球菌198株,检测对苯唑西林的耐药性、产β-内酰胺酶和含mecA(methicillindeterminantA)基因的情况,为临床用药提供参考并且分析菌株对苯唑西林耐药水平与产酶和含mecA基因相关关系。1材料和方法1.1细菌培养和分离收集四川大学华西医院临床微生物室2003年10月至2004年10月从临床送检标本中分离得到的金黄色葡萄球菌198株,经MicroScanWalkAway-40型全自动细菌鉴定仪鉴定,菌株用10%的牛奶保存于-20℃冰箱备用。标准菌株为四川大学华西医院感染性疾病中心实验室提供的金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922。1.2pcr扩增及小量细菌dna提取苯唑西林购自美国SIGMA公司,效价100%;Nitrocephin纸片为法国生物-梅里埃公司产品。根据己公布的mecA序列,由美国LifeTechnologic公司合成针对mecA基因的上游及下游引物,M1:1282-5′-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3′-1303,M2:1739-5′-AGTTCTGCAGTACCGGA-TTTGC-3′-1814;PCR扩增产物为533bp;小量细菌DNA提取试剂盒购自天泰生物有限公司;PCR扩增仪为美国PerkinElmer公司产品,2400型。1.3实验方法1.3.1抗菌药物测试按NCCLS推荐的琼脂平皿对倍稀释法测定抗菌药物对实验菌株的MIC值。实验菌株在M-H琼脂平皿复苏后,挑取单个菌落接种于2mL肉汤中,于震荡器中37℃震荡约6h,比浊仪调整菌液浓度为107cfu/mL,用多点接种仪于含对倍稀释抗菌药物(0.03164～512μg/mL)的M-H琼脂平皿上,每点接种量为104cfu,37℃孵育24h,观察结果。以金黄色葡萄球菌ATCC25923为标准质控菌株。MIC判定标准参照NCCLS2003常规标准。以苯唑西林代替甲氧西林作敏试。金黄色葡萄球菌:对苯唑西林MIC≤2μg/mL为甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA),苯唑西林MIC≥4μg/mL者判定为MRSA,其中MIC≥64μg/mL者为高耐菌株。1.3.2细菌分离和对组合的鉴定采用产色头孢菌素Nitrocephin纸片法测定。实验菌株在M-H琼脂平皿复苏,将纸片逐个排列,用一滴生理盐水浸湿后挑取单个菌落涂布于纸片表面,室温下静置,一般1min内出现阳性结果,最迟可延至1h后观察结果。以金黄色葡萄球菌25923为阳性对照菌株。纸片由黄色变为粉红色即为阳性结果,不变色的为阴性。1.3.3模型的dna准备取1mL菌液按上海华舜生物工程有限公司DNA抽提操作手册进行DNA抽提。1.3.4pcr扩增meca基因3μLDNA模板加入PCR反应体系中,引物11μL,引物21μL、Premix25μL,反应总体积50μL,瞬时离心混匀后置入PERKINELMERPCR仪中94℃10min预变性,94℃30s,54℃45s,72℃45s循环30次,72℃延伸10min。扩增mecA基因时以金黄色葡萄球菌ATCC25923为阴性对照。扩增出mecA基因为阳性,未扩增出mecA基因为阴性。1.3.5双环[35555555555105.5μLPCR产物点入1.5g/100mL琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴乙锭),1×TBE(Tris-硼酸盐缓冲液)为电泳缓冲液,DL2000为Marker,用水平式电泳槽电泳,电压80V,时间1h,300nm紫外灯观察结果,凝胶成像系统成像并作记录。1.3.6统计方法样本间产酶率及含mecA基因率的比较采用χ2检验,α=0.05。2结果2.1mtsae的耐药菌株198株金葡菌对苯唑西林的耐药株为128,耐药率达64.65%,这和各地1998～2003报道的33.9%～65.9%以及我院2002年统计资料的63.5%～88.21%接近;128株MRSA中,对苯唑西林高度耐药菌株为118株(92.19%);对苯唑西林低度耐药菌株为10株(7.81%)。2.2mrsa的产酶率由表1可见,MSSA产β-内酰胺酶率为58.57%;MRSA产β-内酰胺酶率为52.34%,其中高耐菌株产酶率为53.39%,低耐菌株产酶率为40.00%。金黄色葡萄球菌含mecA基因与产酶和耐药的关系见表2。2.3每个菌株都含有meca基因的电泳结果见图1～3,其结果表明各菌株含mecA基因大小及位置都相同,只是所含比例不同。这与表2的结果一致。3meca基因检测产酶的金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素耐药是通过β-内酰胺酶以水解和非水解两种方式灭活抗生素:β-内酰胺酶是大多数致病菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制。金黄色葡萄球菌的β-内酰胺酶是一种胞外酶,分为A、B、C、D4种血清型,这4种酶非常相似,仅在几个氨基酸残基上有所区别,金黄色葡萄球菌的β-内酰胺酶的合成由blaⅠ(penⅠ)、blaZ、blaR1、penP基因调节产生。β-内酰胺酶分为4类,即Ⅰ、Ⅱ(2a、2b、2b′、2c、2d、2e)、Ⅲ、Ⅳ。金黄色葡萄球菌产生的β-内酰胺酶即属于2a亚类,以青霉素为良好底物,是典型的青霉素酶,临床分离的金黄色葡萄球菌80%以上对青霉素耐药可归咎于此酶。本实验检测的118株金黄色葡萄球菌中对苯唑西林高度耐药产β-内酰胺酶菌株为63株,这说明产酶的金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素耐药是通过β-内酰胺酶来灭活抗生素。对苯唑西林敏感产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌(MSSA)为41株,全无mecA基因;这与β-内酰胺酶的量不足有关。不产酶的金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药的主要机制是细菌染色体上编码产生青霉素结合蛋白2(PBP2a)的一段外源DNA,称为mecA基因。该基因在葡萄球菌属中分布广泛,它和细菌染色体上的一些辅助基因,调节基因通过某种机制影响细菌胞壁合成,使细胞表现出不均一耐药。mecA是定位于耐甲氧西林葡萄球菌染色体上的一段2130bp的DNA序列,它和一段约40～60kb的外源DNA一起整合葡萄球菌染色体上,mecA编码产生相对分子质量为78×103的PBP2a。mecA基因序列含有细胞壁合成转肽酶的基因结构特征。一般认为mecA的产物PBP2a是一种替代酶,它与甲氧西林等β-内酰胺类的亲合力低,因此在较高的该类药物浓度下亦不被灭活,可代替其他PBP执行细胞壁合成功能,完整的mecA基因是表达高度甲氧西林耐性所必需的,mecA在调控基因mecR1、mecⅠ及blaR1、blaⅠ的共同作用下产生可诱导的耐药。本实验检测了所收集的全部198株金黄色葡萄球菌产β-内酰胺酶和mecA基因情况,对苯唑西林高度耐药不产β-内酰胺酶菌株为55株,全有mecA基因。对苯唑西林低度耐药不产β-内酰胺酶菌株为6株,其中4株有mecA基因,证实了金黄色葡萄球菌对苯唑西林等耐酶青霉素耐药是与mecA有很好的相关性。另外基因方法可检测出表型敏感却具潜在耐药性的菌株,该类菌含有未表达mecA基因,抗生素治疗过程可诱导其产生PBP2a,而产生耐药性。本实验检测出7株MSSA含有未表达mecA基因。因此检测到的mecA+而表型敏感的金黄色葡萄球菌应提请临床医师注意用药。20世纪90年代,英国KazuhisaMuyakami等在研究MRSA菌株耐药水平和mecA基因转录表达PBP2a的量,以及β-内酰胺酶质粒之间的关系时发现去除了β-内酰胺酶质粒的低耐和高耐菌株表达的PBP2a的量都相同,推测除了mecA之外可能还存在着另外影响耐药表达的因子,后来证实这些基因属于femABX家族成员,与金黄色葡萄球菌高水平耐药有关,这些基因失活可致高耐株菌变为低耐株菌,此方