dna甲基化的研究进展

dna甲基化的研究进展

表观遗传是指基因的不改变，表型中基因的改变和机制。包含了3项基本特征:遗传性,指这些表观修饰在增殖中可以稳定遗传;可逆性,即表观遗传对基因表达的影响可控制或解除;非DNA序列的变化,即核苷酸序列不变,而是通过序列的修饰影响基因表达。表观遗传学修饰主要表现形式有:DNA甲基化,染色质重组,组蛋白修饰,核小体的重塑。这些表观修饰通过调控基因的表达而在细胞中形成独特的表型,影响细胞基因的表达,并将此影响随细胞分裂而遗传下去。因此,表观修饰是一类高于基因水平的基因调控机制,是将基因型与表型联系起来的纽带。DNA甲基化是基因主要的表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要机制,与人类胚胎的发育分化密切相关。其作用体现在多种遗传现象上,包括:基因组印记,基因沉默,X染色体失活等。DNA甲基化的形成机制DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferases,DNMT)的催化下,以S2腺苷蛋氨酸(S2adenosylmethionine,SAM)作为供体将活化的甲基引入DNA链中。甲基化修饰有多种方式,即被修饰位点的碱基可以是腺嘌呤的N26位、胞嘧啶的N24位、胞嘧啶的C25位以及鸟嘌呤的N27位。在哺乳动物细胞的基因组DNA中,约4%胞嘧啶是以5-甲基胞嘧啶形式存在的,这是最常见的甲基化形式。而CpG二核苷酸是DNA甲基化发生的主要位点。在位于转录调控区附近基化区,常成簇存在着富含CpG的DNA片段,约每10bp就出现一个CpG位点,通常长度在1~2kb左右,称为CpG岛。CpG岛一般位于基因的启动子区,有时还包括基因5′端的外显子和内含子,与基因5′端密切相关。健康人基因组中CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态,而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。DNA的甲基化主要是受到DNA甲基转移酶家族的调控。哺乳动物的DNMT的催化区域中存在保守序列含500个氨基酸残基,是催化CpG岛甲基化的活性部位,催化的具体机制为:首先识别并将待甲基化的CpG移至甲基化酶的所谓催化袋(pocket)中,此后酶催化域中的半胱氨酸和待甲基化的胞嘧啶6位在酶的催化作用下形成共价键,与此同时,SAM在甲基化酶的催化下将甲基转移到被激活的胞嘧啶5位上;最后,胞嘧啶6位的共价键断裂,5位的质子释放,而SAM变成S腺苷高半胱氨酸。根据作用DNA甲基转移酶分2种:一种是重新甲基化酶,对于哺乳动物是Dnmt3a和Dnmt3b,是使原来没有甲基化的DNA双链上进行甲基化。另一种是维持甲基化酶,对于哺乳动物即Dnmt1,其主要是催化复制后的半甲基化,也就是在Dnmt1的作用下根据亲链上的甲基化位点进行相应的甲基化修饰的过程,使DNA分子未甲基化的那一条子链甲基化,从而保持子链与亲链有完全相同的甲基化形式,重新甲基化完成后由维持甲基化来维持其稳定的甲基化状态。在细胞增殖分化的过程中,基因的甲基态将遗传给后代。但哺乳动物生殖细胞在形成受精卵后的最初几次卵裂中,发生DNA的去甲基化,即在去甲基化酶的作用下,去除DNA分子上几乎所有从亲代遗传来的甲基化标记,这是一种受到RNA分子调节的核酸替代的过程。此过程包括非特异性去甲基化和特异性去甲基化。胚胎早期的植入期前,整个基因组发生了普遍的非特异性去甲基化,非甲基化状态保持到细胞的桑葚期前。此后的胚胎植入期间,组织特异性基因经历选择性的特异性甲基化。因此,成体基因组通常呈现2种DNA甲基化形式,奢侈基因呈现高密度甲基化,而含有丰富CpG岛的管家基因则呈非甲基化。当细胞内新的甲基化模式形成后,即可通过甲基化酶以“甲基化维持”的形式将新的DNA甲基化传递给所有子细胞。最近Kaminsky等通过研究同卵和异卵双胞胎基因的甲基化情况推断,甲基化的遗传机制和受精卵中的表观遗传差异有关,而不仅由基因的序列决定。DNA甲基化对基因表达的调控DNA甲基化虽然未改变核苷酸顺序及其组成,但普遍认为可在转录水平调控基因的表达,尤其是转录起始阶段,DNA甲基化也正通过这种方式发挥生物学作用。基因启动子及其附近区域内CpG岛胞嘧啶甲基化是众多基因实现去表达和基因印迹的重要途径。由于CpG岛多位于启动子附近区域,是转录的启动区,众多转录因子与DNA结合于DNA的大沟内,而甲基化的5-甲基胞嘧啶的甲基也位于此沟内,从而阻碍了蛋白质因子与DNA间的结合。DNA甲基化还可通过影响DNA分子构象影响基因上游调控区和基因转录因子间的相互作用。有研究表明,E2F,AP2,MYC和YY1要求CpG提供结合位点,其是甲基化依赖的转录因子,于是启动子区的甲基化就通过阻碍转录因子与启动子结合的方式降低基因转录。此外,甲基化DNA位点还可以结合转录抑制子,如甲基化结合蛋白21(MeCP21)和MeCP22,引起基因沉默。转录抑制子对脊椎动物细胞转录起始阶段有抑制作用,对于某些真菌,转录抑制子还能阻断其基因转录的延伸阶段。近年还发现,DNA甲基化可改变染色质结构,也可间接介导转录抑制。另外,DNA甲基化还可能通过降低RNA聚合酶活性而抑制基因的表达。Kangaspeska等最近研究发现,在PS2等基因的DNA启动子区存在短暂的周期性甲基化,这种周期现象与这些基因的一种低水平的再表达相一致。Métivier等进一步发现,通过抑制这一过程阻止了PS2基因的去甲基化进而阻止了基因表达的活性。Erfurth等最近研究发现,MLL蛋白具有防止Hoxa9CpG岛甲基化的作用,并进而影响了基因转录,提示应该有更多的CpG岛结合蛋白具有通过影响甲基化来保证基因转录水平的功能。DNA甲基化对基因的表达抑制需要特异地结合于CpG甲基化位点的MeCPs。MeCP1和MeCP2是目前研究较清楚的甲基化结合蛋白,两者的作用有区别,前者可与对称的多个CpG位点结合,而后者只能与单一的甲基化CpG位点结合。这种基因转录受到甲基化的抑制仅发生在启动子区,而非岛区的CpG甲基化则不抑制基因的转录。对于启动子区,CpG甲基化的密度与基因转录的抑制程度呈正相关。甲基化密度较低时只能完全抑制弱的启动子,而在增强子作用下时,启动子便可恢复基因转录功能;但如果进一步增加甲基化的密度,也可能完全抑制了被增强子增强的启动子的转录。综上,除有些始终非甲基化的组织特异性基因及对甲基化不敏感的基因外,甲基化的高低往往影响着基因表达的程度,通常呈负相关关系,即甲基化水平较低时,基因表达水平较强;反之,甲基化水平较高时,基因表达水平较低。基因启动子及其附近区域内CpG甲基化是众多基因实现去表达(沉默)和基因印迹的重要途径,通过测定启动子CpG岛甲基化状态了解基因是否去表达,为在DNA水平研究基因表达提供重要途径。DNA甲基化的研究方法CpG位点甲基化的分析测定方法根据研究目的主要可分为3类。研究基因组的总体甲基化水平。检测基因组5-甲基胞嘧啶水平属于早期的DNA甲基化分析技术,主要包括5-甲基胞嘧啶免疫学抗体技术、MBD柱层层析、高效液相色谱、高效毛细管电泳、MSssI甲基转移酶分析和氯乙醛反应法等。检测特异位点的甲基化状态。分析特定基因或序列位点甲基化状态的分析技术,包括甲基化敏感性限制性内切酶聚合酶链反应(PCR)/DNA印迹法,甲基化特异性的PCR,甲基化敏感性单链构象分析,直接测序法,重亚硫酸盐限制酶组合分析,甲基化敏感性斑点分析,甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳,甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法,PCR荧光变性曲线分析,甲基化荧光检测(Methylight),甲基化特异性多连接依赖性探针扩增(MS-MLPA),基于寡核苷酸的微阵列法等。寻找新甲基化位点。DNA甲基化相关基因的筛选及新的甲基化位点寻找技术,主要包括限制性标记基因组扫描(RLGS)、甲基化间区位点扩增、DNA甲基化微阵列技术和MBD柱层析技术等。DNA甲基化在妇产科疾病中的研究Bauting等早在1930年首次把异常甲基代谢和疾病的发生联系起来。后研究者进一步发现,缺乏甲基的膳食可能导致体内甲基供体不足以及DNA和特殊基因的异常甲基化,进而引起神经错乱和先天缺陷等病理现象。此后,对DNA甲基化和甲基代谢方面的研究迅速增加。近年发现,基因组DNA异常甲基化可能与多种疾病尤其是年龄相关慢性疾病的发生有关,目前研究较多的是肿瘤。Ehrich等选取四百多个肿瘤相关基因并比较了肿瘤表型和正常表型下这些基因的甲基化情况。结果显示,78个基因在肿瘤的表型下甲基化情况发生改变,其中有7个基因在各种不同形式的肿瘤中都表现出甲基化的异常。在妇产科肿瘤中亦已发现有许多癌变受癌相关基因甲基化的影响。Holm等最近在研究中发现,不同的乳腺癌分子亚型与乳腺组织的DNA甲基化的差异有关,这暗示甲基化在乳腺癌发生中起着重要作用。CelebilerCavusoglu等对P16和CDH1的研究表明,浸润性乳腺癌的肿瘤组织和其周围正常的乳腺组织在这两个基因中的甲基化表达存在差异,而这种差异还存在于在肿瘤周围的正常乳腺组织和无肿瘤的正常乳腺组织之间。Kioulafa等通过分析RASSF1A基因启动子区甲基化状态发现,57.0%早期乳腺癌患者中有RASSF1A基因启动子区甲基化,提示RASSF1A甲基化可能是乳腺癌发生中的早期事件。Joensuu等研究发现,在至少15%子宫内膜癌中有CDH13,APC,GSTP1和TIMP3等4种肿瘤抑制基因发生甲基化,此外还发现RASSF1A甲基化与子宫内膜癌密切相关。目前普遍认为,肿瘤和正常细胞相比,甲基化水平发生了很大改变,具体表现为,在肿瘤发生和发展过程中常出现整个基因组DNA的低甲基化和CpG岛局部甲基化程度的异常升高。前者往往是由于肿瘤细胞中3种DNA甲基化酶活性增高或产生协同作用,或未甲基化的CpG岛的局部保护机制受到破坏而引起,将导致染色体的不稳定以及原癌基因的过度表达;而后者则引起细胞周期调控基因(如Rb)、细胞凋亡基因(如CASP8)、DNA修复基因(如MGMT)、血管形成基因(如THBS1)等癌相关基因的沉默,从而导致癌症的发生。Bloushtain-Qimron等研究发现,转录调控因子FOXC1在CD44+细胞中的低甲基化和高表达诱导了分化的乳腺上皮细胞的祖细胞样表型。Dumont等通过持续诱导乳腺癌中上皮向间叶组织分化的实验阐明,微环境中的信号能诱导表型和基因表达发生定向变化,而该变化与发生在肿瘤形成中的定向重头甲基化改变密切相关,鉴于这种发生在细胞中的动态表观遗传重建,人类肿瘤细胞中观察到的DNA甲基化情况很可能反映了肿瘤起源时环境的变化。众多研究表明,不同的微小RNA(microRNA,miRNA)在正常组织和衍生肿瘤及不同的肿瘤类型之间存在表达的差异,在乳腺癌中发现的miRNA具有肿瘤抑制基因或原癌基因的特性。Lujambio等还发现,这种差异还和肿瘤的转移性有关,而这种差异表达正是通过DNA的CpG岛高甲基化导致具有肿瘤抑制因子特征的miRNA沉默实现的,这成为了人类肿瘤的一个共同标志。目前干细胞学说是肿瘤发生研究中的一大热点。近年诸多研究也预示着甲基化很可能在胚胎和肿瘤干细胞的性能中起到重要作用。Gereige等最近证实,在Dnmt1的作用下,DNA甲基化通过干扰细胞再生和沉默多项分化潜能的程序而保护造血干细胞的基本干细胞特性。Doi等研究发现,人为诱导的多能干细胞,胚胎干细胞和成纤维细胞中CpG岛的组织特异性和肿瘤特异性甲基化的水平存在着显著差异,很多差异甲基化区域在组织分化、表观重建和乳腺癌等多种肿瘤发生中起重要作用。DNA甲基化的研究展望近年随着对表观遗传研究的深入,逐渐认识到甲基化差异在基因调控、表型传递和胚胎发育中起到的重要作用,为众多疾病研究和治疗提供了方向。然而除肿瘤外,对DNA甲基化与其他疾病关系研究目前还主要处于萌芽状态。有研究表明,多种泌尿生殖系统疾病与性激素相关基因的甲基化异常有关,例如雄激素非依赖型前列腺癌中,雄激素受体(AR)的基因启动子区域异常高甲基化在AR表达中起关键作用,而AR表达丧失可导致激素非依赖型前列腺癌的发生。泌尿生殖系肿瘤中部分雌激素受体A-6(ERa-6)表达或表达减少,与ERa基因启动子CpG岛高度甲基化有关。多囊卵巢综合征(PCOS)是妇科发病率很高的疾病,是中国女性不孕症重要原因之一。PCOS的重要表现即是高雄激素血症。目前研究发现,作为一种生殖系统疾病和激素相关性疾病,有理由怀疑PCOS也可能是某些相关基因的甲基化异常引起的。PCOS至今病因尚不明确,推测可能与遗传和环境因素有关。PCOS有家族聚集现象,推测其为一种多基因病,遗传方式可能为常染色体显性也有称为X连锁的显性遗传;有证据表明,雌性胚胎发育时期给予高雄激素,导致成年后有高雄激素/