n-特丁基二甲基硅烷-n-甲基三氟乙酰胺95%衍生高效液相色谱法测定茶叶中游离氨基酸

n-特丁基二甲基硅烷-n-甲基三氟乙酰胺95%衍生高效液相色谱法测定茶叶中游离氨基酸

茶叶中含有丰富的氨基酸。它们是构成茶叶味道的重要因素，直接影响茶叶的质量。氨基酸的测定方法不断改进,由早期的纸色谱、薄层色谱法进行分离后与水合茚三酮进行显色反应,发展到仪器分析为主,如氨基酸自动分析仪法、高效液相色谱法和毛细管电泳法。分析氨基酸的气相色谱仪进行已有许多研究,形成了多种衍生方法,主要有硅烷化、酯化和酰化等,其中硅烷化反应具有一步加热反应完成,反应条件相对温和、快速,操作简便易行,衍生样品可直接进行上机分析等优点,同时反应的碱性环境可使谷氨酸和谷氨酰胺,天冬氨酸和天冬酰胺得到有效分离。目前用于甲基硅烷化反应的衍生试剂主要有N,O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)、N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)及N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氯乙酰胺(MTBSTFA)反应形成叔丁基二甲基氯硅烷(TBS)衍生物。而MTBSTFA在分析化合物特征离子及稳定性方面更优于BSTFA。利用气相色谱-质谱(GC-MS)除了可测定氨基酸浓度外,还可以提供丰富的同位素信息,因此被广泛地用于氨基酸代谢方面的研究。Godber等人利用GC-MS方法对植物木质部转运氨基酸进行了研究;Persson等人建立了GC-MS方法,研究植物对13C和15N双标记氨基酸的吸收;金海如等利用GC-MS分析方法研究了精氨酸在AM真菌菌丝中的双向运输。红波等人建立了测定土壤氨基糖和氨基酸手性异构体氮富集比值的方法,从而可有效区分土壤中原有的和利用外源氮素新合成的氨基化合物。茶氨酸(Theanine)是茶树特有的氨基酸,占茶叶游离氨基酸总量的30%~70%,既是茶叶重要的品质成分,又在茶树氮素营养中占有重要地位,对其代谢过程及影响因子的研究是近年来茶树营养的热点。GC-MS方法提供了丰富的同位素信息,为氮素代谢的研究提供了基础。有关该法研究茶叶中游离氨基酸未见报道,对茶氨酸的衍生特性还不清楚。本文研究了MTBSTFA作为衍生试剂对茶叶中主要游离氨基酸的检测方法。1材料和方法1.1仪器和检测方法气-质联用仪(Trace2000DSQ,ThermoFinnigan公司),配备气谱(Trace2000),质谱(TraceDSQ),气相色谱仪(Agilent7890A,AgilentTechnologies公司),配FID检测器;氨基酸自动分析仪(S-433D,Sykam公司)。1.2衍生试剂及仪器正缬氨酸(Norvaline)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氨基酸标样、衍生试剂N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺(≥95%;MTBSTFA)含叔丁基二甲基氯硅烷(1%;TBDMSCl)等购自Sigma–Aldrich公司(St.Louis,MO)。乙腈(ACN)为国产优级纯。1.3氨基酸浓度标准用超纯水(Milli-Q,Millipore)或0.1mol/L盐酸配制各种氨基酸100mmol/L标准储备液,使用时稀释为10mmol/L及1mmol/L浓度的工作溶液,分别吸取不同的量来设置系列浓度标准。1.4衍生辅助试剂及mtbstca的添加量的确定吸取一定量的氨基酸(10~100μL,含10~100nmol氨基酸)放于2mL的自动进样瓶中,加入40nmol的正缬氨酸作为内标,置于氮吹仪中于室温下吹干,分别加入40~100μL的ACN或DMF衍生辅助试剂、40~100μL的MTBSTFA衍生试剂(MTBSTFA与ACN或DMF的比例为1︰1),加入量依据不同的氨基酸量而定,依设定温度衍生一定时间,反应完成后冷却至室温,待用。1.5氨基酸注射温度GC-MS条件:DB-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm,AgilentTechnologies);载气为高纯氦气,柱流速1mL/min,进样口温度230℃,注射温度270℃,分流比30~50︰1(取决于不同的氨基酸浓度),柱温程序为:起始温度120℃,保持2min,以5℃/min速度升温至270℃,保持10min;进样体积1μL,质谱离子扫描范围为200~510m/z。GC-FID条件:载气氮气,注射温度270℃,柱温程序为:起始温度120℃,保持2min,以3℃/min速度升温至270℃,保持10min。进样体积2μL,其余条件同GC-MS。1.6正氨酸内标溶液取10~1000nmol的氨基酸,各加入40nmol的正缬氨酸内标,加热衍生110℃,30min。冷却至室温后,分别进行GC-MS及GC-FID检测。1.7衍生和测定条件取0.1g茶样,加入5mL超纯水于沸水浴中浸提5min,冷冻离心机离心10min。分为两份,一份为空白对照,另一份加入60nmol的茶氨酸、30nmol谷氨酸、4nmol谷氨酰胺、4nmol丝氨酸、4nmol天门冬氨酸,按上述条件进行衍生和测定。精密度试验中,取100nmol的氨基酸标准,按上述条件衍生,在GC-MS或GC-FID连续测定5次,计算RSD值。1.8样品分析取0.1g茶样,按上述方法提取,提取液分成两份,一份用于GC-MS及GC-FID检测,另一份用于氨基酸自动分析仪分析。2结果分析2.1氨基酸衍生效率衍生反应的效率与反应条件有密切关系,酸度、反应温度、时间和试剂对衍生效果有重要影响。酸性条件(HCl,0.1mol/L)会降低丝氨酸、谷氨酸、茶氨酸、谷氨酰胺等氨基酸的衍生效率,而选用超纯水配制氨基酸具有较高的衍生效率(表1)。表2为不同温度和时间下不同试剂对氨基酸的衍生效率,从表中可以看出,在70℃、5和30min衍生时间条件下,天门冬氨酸、谷氨酸及谷氨酰胺以ACN的衍生效率高于DMF,而在15min衍生时间条件下,衍生效率DMF高于CAN;茶氨酸在较短衍生时间(5、15min)时以DMF的衍生效率较高,衍生时间为30min时,DMF比CAN的低;在110℃的衍生条件下,所有氨基酸的衍生效率均明显提高,天门冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的衍生效率ACN高于DMF,茶氨酸30min衍生的效率也以CAN略高。综合考虑各种氨基酸的衍生,ACN的衍生效率高于DMF。综合各项条件,选用110℃、30min和ACN进行衍生,各氨基酸衍生峰分离度良好(图1、图2)。2.2衍生分子量的结构分析茶氨酸由MTBSTFA衍生经GC-MS分析,产生3个衍生峰,出峰时间分别为19.75、24.60和26.90min(分别为第8、14、16峰)(图1)。通过质谱分析衍生分子量,可推测其结构式。第1个茶氨酸峰的相对分子质量为357(图3-a、图3-d);第2个茶氨酸峰的相对分子量为402(图3-b、图3-e和图3-f),即有1个氨基端没有被衍生;第3个茶氨酸峰为完全衍生峰,相对分子质量为516(图3-c、图3-g)。2.3内标和外测目标的分离效果正缬氨酸是一种较常用且不存在于茶叶中的氨基酸。与待测目标的分离效果很好,不会影响目标氨基酸峰的分离,且精密度比较高(RSD<0.2%,n=6),因此选用正缬氨酸为内标。2.4仪器测定结果采用上述衍生条件,分别以各种氨基酸峰面积y(经内标较正)对各氨基酸量x(nmol)作线性回归。各回归方程的相关系数R2均大于0.99,相关性较好(表3)。取100nmol的氨基酸标液衍生后,连续上机测定5次,GC-MS与GC-FID两种检测的RSD均小于5%,表明测定的精密度良好(表4)。同一茶样提取液分别用GC-MS、GC-FID检测和氨基酸自动分析仪分析,各仪器测定结果基本一致(表5),具有可比性。填加回收试验表明,茶氨酸的回收率为107%,其余几种氨基酸的回收率均高于85%(表6)。3衍生条件的影响利用气相色谱仪或气-质联用进行氨基酸分析,前人已有许多研究[8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19],但未见对茶叶中游离氨基酸分析的研究报道,对茶氨酸的衍生特性也不清楚。氨基酸硅烷化衍生对于温度、时间以及衍生试剂都十分敏感,本研究表明,不同温度、时间条件下茶氨酸经MTBSTFA衍生均产生3个衍生峰,最先出现的1个峰很小,为环状化合物,不会影响茶氨酸及其他氨基酸,而中间出现的峰为不完全衍生峰,即有1个氮端没有被衍生,最后出现的峰可能是茶氨酸的完全衍生峰,符合一般的MTBSTFA衍生产生的离子碎片结构特征。在两种有机溶剂中,DMF有时比ACN的完全衍生峰要高,而不完全衍生峰低一些,但线性没有ACN的好。而就温度而言,对各种氨基酸均产生影响,且茶氨酸随着温度的升高,其完全衍生峰的峰面积也增大,当温度为30℃,衍生时间为5min时,第1个环状峰及第2个不完全衍生峰比第3个完全衍生峰面积大,随着衍生时间延长、温度升高,完全衍生峰(第3个峰)面积增大,且高于其余两个峰;在70℃、5min和110℃、30min时,第3个峰与第2个峰面积比相当,但是在110℃条件下衍生峰的绝对面积大,说明衍生效率更高。