复元活血汤药理学研究

复元活血汤药理学研究

李东恒将福元活血汤引入医学创新体系。最初的配方由柴胡15克、大楼根9克、当归9克、红花6克、甘草6克、盔甲6克、大黄（酒浸泡）30克和桃仁（酒浸泡、去皮尖）9克组成。本方证为跌打损伤,瘀血停滞于肋下所致,血瘀气滞,故痛不可忍。治当以活血祛瘀为主,兼以疏肝行气通络。复元活血汤原方中重用大黄荡涤留瘀败血,柴胡疏肝调气,两药合用以攻散肋下之瘀滞,共为君药;当归、桃仁、红花活血化瘀,消肿止痛,共为臣药;穿山甲破瘀通络;栝楼根既能入血分助诸药而消瘀散结,又能清热润燥,正合血气瘀久化燥之证,共为佐药。甘草缓急止痛,调和诸药,是为使药。各药合用,使瘀血新生,气行通络,则肋痛自平。故《成方便读》(张秉成)说:“去者去,生者生,痛自舒而元自复”。故方名“复元”。由于本方活血化瘀止痛之力较大,七百多年来,颇为历代医家所重视,有“伤科第一方”之称,广泛用于跌打损伤,瘀血留于肋下,痛不可忍。近些年来,本方临床应用范围不断扩大,已用于脉管炎、肋软骨炎、腰痛、神经痛、肝胆病、乳腺增生、妇科病、糖尿病、脑出血、肺心病、肠粘连等病证。但有关本方的药理作用系统研究极少,仅见窦氏关于复元活血汤活血化瘀作用的一篇报道,由于复元活血汤的临床应用主要涉及其镇痛、抗炎和活血化瘀等功效,故本实验拟对复元活血汤进行镇痛、抗炎、活血化瘀等药理作用实验研究。1材料和方法1.1c-ms-na柴胡、栝楼根、当归、桃仁(去皮尖)、红花、甘草、穿山甲(炮)、酒大黄、延胡索均为市售中药材。按文献方法称取柴胡15g、瓜蒌根、当归各9g、红花、甘草、穿山甲各6g、酒大黄30g、桃仁9g,放入烧杯加水100ml浸泡1h后,大火煮沸30min,文火微沸1h,纱布过滤,药渣加水同前法再煎一道后过滤,合并两次滤液,于水浴上浓缩至浓度为100%水提物(含生药1g·ml-1)备用;阿斯匹林(湖北制药厂,批号9803027,上药于临用前用1%CMC-Na配成混悬液备用)、伊文思蓝(上海化学试剂采购供应站经销,行知校办厂分装,批号821102)、乌拉坦(北京化工厂,批号930515)均为市售;二甲苯、乙酸、氯化钠均为国产分析纯。1.2g医学实验动物中心提供了临床动物中心昆明种雌性未孕小鼠,体重20~24g,湖北省医学实验动物中心提供;昆明种雄性小鼠,体重18~24g,武汉大学医学部实验动物中心提供。1.3分光光度计和光学显微法YJ501型超级恒温水浴(上海跃进医疗器械厂);Bs200s电子天平(Sartorins公司);722S分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);光学显微镜JNOECXS-212-201;显微测微尺(R=0.01mm);TL04A离心机(北京大恒建海科贸公司);打孔器(0.9mm),秒表。1.4连续给药对小鼠的痛行为测定取雌性小鼠置于(55±0.5)℃的金属板上,以舔后足为痛反应指标,共测2次,以每次不超过30s者为合格鼠,取平均值为给药前痛阈值。将预选合格小鼠随机分为4组(见表1),按每天0.1ml·(10g)-1体重连续灌胃3d,于末次给药后,每隔30min测定痛阈值一次,共4次,如痛阈值超过60s,即停止测试,按60s计。实验结束后,按不同时间测定的痛阈值,与对照组比较,进行t检验,并按以下公式计算用药后痛阈值提高百分率。痛阈值提高率=给药后平均痛阈值-给药前平均痛阈值给药前平均痛阈值×100%=给药后平均痛阈值−给药前平均痛阈值给药前平均痛阈值×100%1.5单次给药后小鼠的情况取小鼠40只随机分为4组(见表3),每天按0.1ml·(10g)-1体重灌胃给药,连续3d,于末次给药后1h腹腔注射0.6%醋酸溶液0.1ml·(10g)-1,记录小鼠从注射醋酸到开始扭体的潜伏期及给药后20min内扭体次数,做组间t检验,并计算镇痛百分率。镇痛率=生理盐水组平均扭体次数-药物组平均扭体次数生理盐水组平均扭体次数×100%=生理盐水组平均扭体次数−药物组平均扭体次数生理盐水组平均扭体次数×100%1.6小鼠水肿试验取小鼠40只,随机分为4组(见表4),按每天0.1ml·(10g)-1灌胃给药,连续3d,于末次给药后1h将二甲苯0.05ml涂于小鼠右耳廓前后两面,左耳不涂为对照,致炎后1h脱颈椎处死小鼠,用9mm打孔器冲下左右耳的圆耳片,于电子天平上称重,以左右耳片重量之差作为肿胀程度指标,与对照组比较,进行t检验,并计算肿胀抑制率。1.7小鼠血清中伊文思兰的表达取小鼠30只,随机分为3组(见表5),各鼠按0.1ml·(10g)-1·d-1灌胃给药,连续3d,分别于给药后1h尾静脉注射伊文思兰生理盐水溶液(20g·L-1)0.1ml·(10g)-1,并立即注射0.6%醋酸0.2ml/只,20min后断头处死小鼠,剪开腹腔,用5ml生理盐水冲洗腹腔数次,收集洗涤液,调整至5ml,离心(1500r·min-1)10min,在722S型分光光度计590nm波长处进行比色测定,记录吸收度(OD值)。实验后根据所测伊文思蓝标准曲线,计算各样本中伊文思蓝的含量。1.8小鼠耳廓动脉微核试验取雄性小鼠24只,随机分为3组(见表6),实验前先用胶布沾掉小鼠耳廓两面绒毛,腹腔注射20%乌拉坦,麻醉后将小鼠俯卧显微镜载物台上,耳廓与载玻片间滴加液体石蜡,固定好小鼠,调节载物台高度和冷光源亮度,60倍镜下,用显微测微尺测量给药前小鼠耳廓动脉管径,静脉管径,毛细血管交叉点数。各组按每天0.1ml·(10g)-1体重灌胃给药,连续3d,于末次给药后30min观察小鼠耳廓同一部位的动脉及静脉管径和毛细血管交叉点数,分别以前后变化值为指标,与对照组比较,进行t检验。2结果2.1复元血清汤小剂量组p>0.05由表1和表2可见,与生理盐水组比较,大小剂量的复元活血汤组可明显提高小鼠热板痛阈值(P<0.05或P<0.01),复元活血汤小剂量组作用与阿斯匹林组强度相当(P>0.05)。60min时复元活血汤大剂量组作用强于阿斯匹林组(P<0.01)。由上可见复元活血汤在30min已开始起效,60min处发挥最大镇痛作用,120min后仍有镇痛作用。2.2复元活检汤对小鼠扭体次数的影响由表3可见,与生理盐水组比较阿斯匹林组和大小剂量的复元活血汤组明显抑制醋酸所致的小鼠扭体次数(P<0.01),延长扭体发生的潜伏期。但药物组间没有显著性差异。2.3复元血汤对二甲苯致小鼠耳廓水肿度的影响由表4可见,阿斯匹林组及大小剂量复元活血汤组可显著抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀度(P<0.05),但与阿斯匹林组比较,复元活血汤组耳廓肿胀度均大于阿斯匹林组。2.4伊文思蓝分光光度法由表5可见,大小剂量的复元活血汤可降低腹腔洗出液的光密度值,与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05)。伊文思蓝标准曲线的绘制:取伊文思蓝0.0574g,加生理盐水50ml配成1.0148×10g·ml-1,再分别稀释50,100,200,250,500倍,得标准试管5只,在590nm波长处用722s分光光度计测其吸光度,分别为0.666,0.316,0.159,0.102,0.051用计算器作回归方程。OD=3.3858×104C-0.0229(R=0.9994)2.5小剂量复元活汤组大鼠造林后血管内皮功能指标变化由表6可见,大剂量复元活血汤组扩张动脉作用较显著(P<0.05),小剂量复元活血汤组扩张静脉作用较显著(P<0.05),毛细血管交叉点数的变化无显著性差异。3复元活汤的药养作用镇痛实验结果可见,复元活血汤可提高小鼠热板痛阈值;延长扭体潜伏期和减少扭体次数,结果表明复元活血汤有镇痛作用,其在给药后30min已开始显效,120min仍有镇痛作用。现代研究发现当归、穿山甲、甘草、杏仁均有镇痛作用,这可能是复元活血汤镇痛作用的基础。抗炎实验结果可见,复元活血汤能显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀,高剂量组强度相当于阿斯匹林;腹腔毛细血管通透性实验可见复元活血汤可降低腹腔洗出液的光密度值,结果表明复元活血汤有抗炎作用。现代研究报道柴胡具有显著抗炎、抗渗出作用;大黄能降低毛细血管的通透性、脆性,减少渗出;甘草也具有可的松样抗炎、抗渗出的作用,这可能是复元活血汤抗炎作用的基础。由微循环实验可见,复元活血汤大剂量组扩张小鼠耳廓微动脉作用较显著(P<0.05),复元活