二维核磁共振谱

二维核磁共振谱二维核磁共振的概述1．什么是二维谱二维核磁共振(2DNMR)方法是有Jeener

于1971年首先提出的,是一维谱衍生出来的新实验方法。引入二维后，减少了谱线的拥挤和重叠，提高了核之间相互关系的新信息。因而增加了结构信息，有利于复杂谱图的解析。特别是应用于复杂的天然产物和生物大分子的结构鉴定，2DNMR是目前适用于研究溶液中生物大分子构象的唯一技术。一维谱的信号是一个频率的函数，记为S(ω)，共振峰分别在一条频率轴上。而二维谱是两个独立频率变量的信号函数，记为S(ω1，ω2)，共振峰分布在由两个频率轴组成的平面上。2D-NMR的最大特点是将化学位移、偶合常数等参数在二维平面上展开，于是在一般一维谱中重叠在一个频率轴上的信号，被分散到两个独立的频率轴构成的二维平面上，同时检测出共振核之间的相互作用.2二维谱实验A.原则上二维谱可以用概念上不同的三种实验获得：(1).频率域实验(frequency-frequency)(2).混合时域(frequency-time)实验(3).时域(time-time)实验.它是获得二维谱的主要方法,以两个独立的时间变量进行一系列实验,得到S(t1,t2),经过两次傅立叶变换得到二维谱S(ω1,ω2).通常所指的2D-NMR均是时间域二维实验

B)二维核磁共振时间分割二维谱实验中，为确定所需的两个独立的时间变量，要用特种技术－时间分割。即把整个时间按其物理意义分割成四个区间。（如图所示）（1）预备期：预备期在时间轴上通常是一个较长的时期，使核自旋体系回复对平衡状态，在预备期末加一个或多个射频脉冲，以产生所需要的单量子或多量子相干。（2）发展期：在t1开始时由一个脉冲或几个脉冲使体系激发，此时间系控制磁化强度运动，并根据各种不同的化学环境的不同进动频率对它们的横向磁化矢量作出标识。（3）混合期：在此期间通过相干或极化的传递，建立检测条件。（4）检测期：在此期间检测作为t2函数的各种横向矢量的FID的变化以及它的初始相及幅度受到t1函数的调制。C.实验过程：用固定时间增量⊿t1依次递增t1进行系列实验，反复叠加，因t2时间检测的信号S(t2)的振幅或相位受到s(t1)的调制，则接收的信号不仅与t2有关，还与t1有关，每改变一个t1，记录S(t2),因此得到分别以时间变量t1,t2为行列排列数据矩阵，即在检测期获得一组FID信号，组成二维时间信号S(t1,t2)。因t1,t2是两个独立时间变量，可以分别对它们进行傅立叶变换，一次对t2,一次对t1,两次傅立叶变换的结果，可以得到两个频率变量函数S(ω1,ω2)。如图3．二维谱的表达方式（1）堆积图(stackedplot).堆积图的优点是直观,具有立体感.缺点是难以确定吸收峰的频率。大峰后面可能隐藏小峰，而且耗时较长。(2)等高线（Contourplot）

等高线图类似于等高线地图，这种图的优点是容易获得频率定量数据，作图快。缺点是低强度的峰可能漏画。目前化学位移相关谱广泛采用等高线。图4.3堆积图等高线4．二维谱峰的命名（1）交叉峰（crosspeak）:出现在ω1≠ω2处，（即非对角线上）。从峰的位置关系可以判断哪些峰之间有偶合关系，从而得到哪些核之间有偶合关系，交叉峰是二维谱中最有用的部分。（2）对角峰（Autopeak）:位于对角线（ω1＝ω2）上的峰，称为对角峰。对角峰在F1和F2轴的投影。5．二维谱的分类二维谱可分为三类：1）J分辨谱（Jresolvedspectroscopy）

J分辨谱亦称J谱或者δ-J谱。它把化学位移和自旋偶合的作用分辨开来，包括异核和同核J谱。2）化学位移相关谱(chemicalshiftcorrelationspectroscopy)

化学位移相关谱也称δ-δ谱，是二维谱的核心，通常所指的二维谱就是化学位移相关谱。包括同核化学位移相关谱，异核化学位移相关谱，NOESY和化学交换。3）多量子谱（multiplequantumspectroscopy）用脉冲序列可以检测出多量子跃迁，得到多量子二维谱。化学位移相关谱（CorrelatedSpectroscopy,COSY）

二维化学位移相关谱包括同核化学位移相关谱（Homonuclearcorrelation）1）通过化学键：COSY,TOCSY,2D-INADEQUATE。2）通过空间：NOESY,ROESY。异核化学位移相关谱(Heteronuclearcorrelation）强调大的偶合常数：1H-13C–COSY强调小的偶合常数，压制大的偶合常数：COLOC(远程1H-13C–COSY)

同核化学位移相关谱一、COSY(Correlatedspectroscopy)

所谓的COSY指同一自旋体系里质子之间的偶合相关。1H-1H-COSY可以1H-1H之间通过成键作用的相关信息，类似于一维谱同核去偶，可提供全部1H-1H之间的关联。因此1H-1H-COSY是归属谱线，推导结构及确定结构的有力工具。1、COSY－90。的基本脉冲序列包括两个基本脉冲。在此脉冲作用下，根据发展期t1的不同，自旋体系的各个不同的跃迁之间产生磁化传递，通过同核偶合建立同种核共振频率间连接图。此图的二个轴都是1H的δ在ω1＝ω2的对角线上可以找出一维1H谱相对应谱峰信号。通过交叉峰分别作垂线及水平线与对角线相交，即可以找到相应偶合的氢核。因此从一张同核位移相关谱可找出所有偶合体系，即等于一整套双照射实验的谱图。

COSYof2－丁烯酸乙酯三。NOESY（NuclearOverhauserEffectSpectroscopy)核间磁化传递是通过非相干作用传递，这种传递是靠交叉驰豫和化学交换来进行。即样品间偶极－偶极传递的。NOESY的基本序列在COSY序列的基础上，加一个固定延迟和第三脉冲，以检测NOE和化学交换的信息。混合时间tm是NOESY实验的关键参数，tm的选择对检测化学交换或NOESY效果有很大影响。选择合适的tm,可在最后一个脉冲，产生最大的交换，或建立最大的NOE.NOESY的谱图特征类似于COSY谱，一维谱中出现出现NOE的两个核在二维谱显示交叉峰。NOESY可以在一张谱图上描绘出分子之间的空间关系。Codeine的NOESY6,7359101211Codeine在高场放大的NOESY13’131818’161717’11148-7,12

7-18,18'

3-5,10

5-11,16,18'

9-10,17,17'

10-16

11-18,16,14,18'

18-13,18'

16-14,17

13-14,17,17'

13'-17,17'

17-17‘TableofNOEs

TOCSY

TOCSY脉冲序列：是一种旋转坐标系实验（自旋锁定实验），自旋锁定是把COSY序列中的第二脉冲以及NOESY序列中最后两个脉冲（包括混合时间），用一个长射频脉冲取代，把自旋沿着旋转坐标系的一个锁定，在这种情况下不存在化学位移差，通过发生标量偶合的磁化转移，导致了全部相关。质子a、b、c、d构成自旋体系既一个偶合系统，CH3CH2构成另外一个偶合系统。这是两个独立的自旋体系，COSY：CH2a与CH2b相关。而TOCSY：它不仅显示a与质子b相关，而且也与两个(CH2)

c、d相关。

TOCSYofcodeineCOSYTOCSY391012111816,13,14,13’183,163,53,163,953-103,103,5

TableofTOCSYpeaks:

('indicatesthemoreupfieldofgeminalCH2protons)8-->7

3-->5,9,10,16

5-->9,10,b11,16

9-->10,16,OH,H2O

10-->16,OH,H2O

11-->16,18,18'

18-->16,18'

16-->18'

13-->13',17,17'

13'-->17,17'

17-->17'ROESY若采用一个弱自旋锁场，则在旋转坐标体系中产生交叉驰豫NOE,得到ROESY谱（RotatingNOE),即旋转坐标系中的NOE增强谱。它类似于NOESY，能提供空间距离相近的核的相关信息。它的基本序列与TOCSY相似，但采用低功率自旋锁场，可由连续波照射或一系列小脉冲角脉冲组成混合脉冲。ROESY与NOESY区别：NOESY在分子量大和小的分子体系中，灵敏度很高。小分子的快速运动，产生NOE,大分子的或降温产生负NOE.而中等分子（300～1500）或特殊形状分子，在NOESY中得不到交叉峰。而ROESY交叉峰与分子量的大小无关。由于ROESY是低的功率实验，可以检测到小的相互作用。异核化学位移相关谱-HeteronuclearCorrelationofchemicalshift

所谓异核化学位移相关谱是两个不同核的频率通过标量偶合建立起来的相关谱.应用最广泛的是1H-13CCOSY.

常规的1H-13CCOSY是指直接相连的C-H之间的偶合相关（1JCH）。1H-13C-COSY谱图中F2为13C化学位移，F1为1H化学位移，没有对角峰，其交叉峰表明C-H偶合的信息。解析时，可以从一已知的氢核信号，根据相关关系，即可找到与之相连的13C信号，反之亦然。可以从谱图中得到1JC-H的结构信息。13C-1HCOSY2-丁烯酸乙酯ADCB7.78.157.47.5111.6120.6122.6127COLOC(CorrelationSpectroscopyvialongrangecoupling)和1H-13C-COSY序列基本一样，只是在COLOC谱中对应于远程C-H偶合常数nJ(2JCH,3JCH)，而不是1JCH。得到一键以上的CH偶合相关信息，建立C-C之间的关联，可以跃过N,O等其它官能团。成为推导结构归属信号，解决由于屏蔽效应难以解决的季碳归属的有力工具。由于该方法能够将季碳和相邻碳的质子相关，对于确定C-C连接非常有效。常规的1H-13C-COSY没有季碳和其它质子的相关峰。COLOC谱图类似于C-H-COSY,两个坐标（F1,F2)是化学位移，交叉峰也类似于C-H-COSY，只是出现了小偶合的相关峰。COLOC最大的缺点是相关峰中包含所有的1JCH信号。解析谱图时一定要对照C-H-COSY。确定1JCH,分辨出2JCH,3JCH.多量子跃迁谱常见的核磁是选择的单量子跃迁。在偶极相互作用及其影响下，自旋体系的能级不再由单一态波函数，而变成混合态，可能出现多量子跃迁。产生的多量子跃迁不能直接观察到，要把它变回可观察的单量子跃迁才能进行检测，得到S(t1,t2)后经过傅立叶变换得到频率谱。常见的多量子跃迁谱有HMQC、HMBC。与1H-13CCOSY、COLOC谱相似。由于多量子相干转移，使其灵敏度大大提高。对于测定时间相等的条件下所需的样品量为：

1H-13CCOSY5~10mg(20mM)COLOC5~10mg(20mM)HMQC1mg(5mM)HMBC2~3mg(7mM)因此这两种方法为分子量大的微量样品的测定提供了广阔的前景。HMQC

(1-bondCHcorrelation)

1H检测的异核多量子相干谱HMQC是将1H信号的振幅及相位分别依13C化学位移及1H间的同核化学偶合信息调制，并通过直接检测调制后的1H信号，获得13C-1H化学位移相关数据。它所提供的信息及谱图与1H-13CCOSY完全相同。及图上的两个坐标分别是1H,13C化学位移，直接相连的13C与1H将在对应的13C化学位移与1H化学位移的交点处给出相关信号。不能得到季碳的结构信息。HMQCofCodeine13CAssignment6.611386.512075.713335.312854.89194.266103.856123.359113.0&2.320182.640162.6&2.446132.443142.0&1.83617HSQC-DEPT这个实验有一个变化，显示CH2与CH、CH3有不同的相位。CH2显示负的相位，在下图中用红色表示。在Codeine中的三个CH2很容易辨认。这种技术称之为HSQC-DEPTspectrum.

HSQC-DEPTofCodeineHMBC

(multiple-bondCHcorrelation)HMBC是一种测定远程1H-13C相关的十分灵敏的方法，它给出远程1H-13C相关信息。特别是适用于检测与甲基有远程偶合的碳（2JCH,3JCH).其基本原理是：通过1H检测异核多量子相干调制，选择性地增加某些碳信号的灵敏度，是孤立的自旋体系相关联，而组成一个整体分子。对于质子相隔两个、三个键(2JCH,3JCH)的碳，提供了有效的相关信息，抑制了直接偶合的1JCH信号强度使谱图简化。该法适用于具有众多甲基地天然产物，如三萜化合物，甾醇化合物的结构鉴定。HMBC可高灵敏度地检测13C-1H远程偶合(2JCH,3JCH)，因此可得到有关季碳的结构信息及其被杂原子切断地1H偶合系统之间的结构信息。利用二维核磁共振推导未知化合物的结构1、确定化合物的分子式，计算不饱和度。2、官能团推导。3、氢谱与碳谱信号的指认4、结构片断的推导5、结构片断的连接6、立体化学的确定7、归属化合物的信号验证结构。例1。下面未知化合物的分子式是C25H28O5，根据下面的核磁谱图推导化合物的结构DEPT2.56~2.602.301.461.79~1.897.316.86COSYHMQC94.5(6)103.1(4a)161.8(5)H-3196.878.7130.830.4(C-2”)46.5(C1”)107.0(c-8)148.3(C8”)160.6(8a)163..1(7)109HMBC1.确定化合物的分子式，计算不饱和度。该化合物分子式为C25H28O5，不饱和度为12。2.

H、CNMR的信号进行指认DEPT显示化合物中有2个甲基，6CH2、5CH、10C.2个Me(1.59,22.5)(1.61,19.0)4。结构片断3.考虑分子的对称性有2个对称碳δ5.29(dd,J=13.2,2.9HZ,H2),3.03(dd,J=17.2,2.9,H-3),2.77(dd,17.2,13.2H-3)是典型黄酮。12.99羟基表明是5－羟基黄酮。碳谱中还有11个sp2杂化碳进一步证明是黄酮结构。7.31（d,2H,J=8.8HZ)6.86(d,2H,J=8.8Hz),表明存在对位取代的苯基。10746。5148。330。4160。6163。1146。31。59，22。51。6119148。319146。222。55。分子片断的连接94.5(6)103.1(4a)161.8(5)H-3196.878.7130.830.4(C-2”)46.5