动物细胞工程课件

绪论Chapter1INTRODUCTION第一节动物细胞工程的产生和发展细胞工程(cellengineering)是以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。细胞工程与基因工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程一起构成了生物技术领域。生物技术的兴起，不仅反映出生物学飞跃到一个与过去无法比拟的新水平，而且也反映出人类有效控制生物过程为人类造福的时代已经开始。1859年，法国解剖学家Vulpian最早尝试将蛙(Rana)胚尾部组织切下，放到普通水中“培养”，观察到组织的生长和分化现象；1903年，Jolly用盖片悬滴法将蝾螈(Ambystomamaculatum)白细胞培养了将近一个月。1906年，Beebe和Ewing用动物血清作培养基，将狗(Canisfamiliaris)淋巴肉瘤细胞培养2h，并观察到细胞生长现象。

1907年，Harrison在无菌条件下，从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养，开创了动物组织培养的先河。探索期细胞培养技术方面：1923年，Carrel设计了卡氏培养瓶。Carrel把外科手术的无菌操作观念带到了细胞体外培养实验中，在解决细胞培养的营养和污染方面作出了贡献。1953年，Gey等以人的肿瘤组织为材料成功地建立了HeLa细胞系。成熟期在细胞融合方面：

1954年，Enders等人观察到麻疹病毒能使离体培养的宿主细胞产生多核体；1958年，Okada发现紫外线灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。1965年，Harris成功诱导了不同种动物体细胞的融合，并能存活下去。由于仙合病毒能够稳定地诱发细胞融合而引起了很多科学家的兴趣。在克隆技术方面：1892年，Driesch把海胆(Strongylocentrotusperpuratus)2细胞胚胎通过剧烈振荡分成2个细胞进行单独培养，发现每一个分裂球都能够发育成个体较小的完整幼虫。1933年，Conklin以振荡方法研究2细胞和4细胞期文昌鱼胚胎分裂球的发育能力，发现沿第一次分裂面分开的左右两部分能形成2个完整幼体。20世纪40~50年代，童第周等在鱼类上进行了相似研究，获得了孪生小鱼。在多倍体诱导技术方面：1939年，Fankhauser和Griffiths在两栖类中成功诱导出三倍体。1945年，Swardson采用低温处理白鲑(Salmo)受精卵，获得三倍体囊胚。真正诱导三倍体鱼类成功的是Swarup，他用低温处理三棘刺鱼(Gasterosteusplatessa)获得了三倍体，并饲养至性成熟。迅速发展期1975年，kohler和Milstein为了获得单一抗体,利用仙台病毒诱导小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术，筛选出既能持续分泌单克隆抗体、又能无限增殖的杂交瘤细胞。这一工作把细胞融合技术从实验研究推广到疾病的临床诊断等应用研究，使免疫学走向了新阶段。从此，很多国家都开展了单克隆抗体的研究工作，使细胞工程逐渐茁壮成长起来。迅速发展期曹谊林教授在小鼠身上培育的人耳迅速发展期人工培养的肌肉迅速发展期波尔山羊的胚胎工程迅速发展期体细胞克隆羊——

多莉

迅速发展期转基因鱼迅速发展期转基因克隆猪第一节动物细胞工程的产生和发展第二节动物细胞工程的主要技术领域本章讲授提纲第三节国内动物细胞工程的研究简况第二节动物细胞工程的主要技术领域细胞培养细胞融合细胞拆合哺乳动物胚胎培养和胚胎移植转基因技术哺乳动物克隆技术动物细胞工程的研究涉及了许多技术领域，概括起来主要包括以下几个领域：组织工程一、细胞培养动物细胞培养原代培养继代培养规模化培养二、细胞融合杂交瘤技术与单克隆抗体动物细胞融合和动物新品种培育三、细胞拆合物理法化学法四、哺乳动物胚胎培养和胚胎移植哺乳动物胚胎培养技术哺乳动物胚胎移植技术哺乳动物的无性繁殖技术哺乳动物嵌合体的制作技术胚胎干细胞的体外培养技术五、转基因技术六、哺乳动物克隆技术哺乳动物胚胎分割技术哺乳动物胚胎细胞克隆技术哺乳动物体细胞克隆技术七、组织工程

组织工程是应用工程技术和生命科学的原理和方法来解释生理和病理状态下哺乳动物的组织结构与功能之间的关系，研究生物替代物，以恢复、维持或改进组织功能的一门新兴学科。Reddi于1994年最初提出

组织工程包括三个组成部分：一是提供细胞附着的细胞外间质；二是提供细胞的应答信号；三是触发组织形成的调节信号。

具备上述三个条件，组织或细胞就可以在体外进行三维培养，形成所需要的组织、器官。第一节动物细胞工程的产生和发展第二节动物细胞工程的主要技术领域本章讲授提纲第三节国内动物细胞工程的研究简况第三节国内动物细胞工程的研究现状1、单克隆抗体2、家畜胚胎移植3、核移植技术5、胚胎干细胞4、转基因动物技术1、单克隆抗体近几年来，淋巴细胞杂交瘤技术发展很快。至1985年底，已研制成功了抗胃癌、抗肺癌、抗乙型肝炎表面抗原、抗疟疾、抗丝虫等47类单克隆抗体。其中，抗乙型肝炎病毒单克隆抗体已投入了临床应用，创造了一定的经济效益。131I-Hab18肝单抗用于肝癌病人放免显像诊断，显像率达90.6%;肿瘤定位最小直径为0.5cm，用于导向治疗，疗效为69％。马传染性贫血猪瘟鸡新城疫草鱼出血病等农用单克隆抗体研究，已研究制成一大批单克隆抗体试剂盒：并应用于动物疫病的快速诊断。在家畜胚胎移植技术方面，中国科学院遗传研究所以及其它农业科研机构等单位已取得了一些成果。山东省农业科学院在兔胚移植研究方面已初获成功。西北农业大学研究生张涌（1987），中国农业科学院朱裕鼎领导的课题组（1987年）利用胚胎切割技术繁殖半胚绵羊获得成功。2、家畜胚胎移植我国利用移核技术培育新型鱼已获得实际应用成果。3、核移植技术生长快、质量好，增重速率比亲本荷包红鲤快20％，而且蛋白质含量高，具有一定的经济效益。荷包红鲤细胞核鲫鱼细胞质鲤鲫移核鱼中科院发育所、水科院长江所和广西水产所等单位：我国在鱼类远缘核移植技术方面达到了国际先进水平核移植此项研究成果已于1986年通过鉴定特别值得提及的是，中科院生殖生物学国家重点实验室以陈大元为首的课题组，1999年将熊猫体细胞核植入家兔的去核卵中，移核卵在体外培养中发育到胚泡阶段。熊猫属食肉目动物，家兔属兔形目，如此远缘核质杂交体能发育到囊胚，在世界上尚属首例。此项研究成果被中国科学院院士评选为1999年中国十大科技成果之一。转基因动物技术被应用于动物育种，我国已获得生长激素的转基因猪200余头，转基因猪的生长水平高20%。上海医学遗传研究所利用生物反应器技术获得40头乳腺特异表达外源基因的转基因羊，首批转基因羊乳汁中分泌生长激素的含量已达400mg/L。中科院发育所和江苏省生物工程重点实验室已建成在乳腺中高效表达促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)转基因山羊50头。4、转基因动物技术从20世纪80年代开始，一批学者又致力于胚胎干细胞(embryonicstemcell,EScell)的研究，中科院上海细胞所丛笑倩等以及中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室卢光琇等在这方面作了大量工作并已建立了自己的ES细胞系；中科院发育所郑瑞珍以及北京大学生命科学学院尚克刚等都在ES细胞的分离培养方面作出了杰出的贡献。5、胚胎干细胞在动物细胞培养方面，我国的研究成果丰硕。建国以来，迄今已建立了100多个细胞株和系，为生物学和医学基础研究提供了大量的宝贵材料。从目前情况来看，我国在动物细胞工程研究领域已建成了许多基地，各种技术门类已初步建立，有些领域已经跨入了国际先进行列。今后的主要任务是向研究的深度发展，把基础研究搞上去，提高研究水平。

哺乳动物克隆技术随着1997年2月Nature杂志报道英国Roslin研究所I.Wilmut等人创造的克隆羊多莉(Dolly)诞生，生物工程掀开了新的一页。克隆(clone)一词原意为无性繁殖系，在体外培养的细胞中早有使用，细胞克隆是指由一个细胞经细胞分裂而产生出的一群细胞，而动物克隆是指由一个动物经无性繁殖而产生的遗传性状完全相同的后代个体。卵细胞供体羊ScottishBlackfacesheepDollyDollyFinnDorset(FosterMother,寄母)核供体羊克隆羊“多莉”诞生后，克隆技术研究立即成为世界各国生物学家竞相开展的生物学高新技术研究。克隆技术之所以一经产生立即引起高度重视，是因为克隆技术不但具有重要的理论意义而且具有良好的应用前景。第一节哺乳动物克隆的发展历史讲授提纲第七章哺乳动物克隆技术第二节哺乳动物克隆的技术方法第三节克隆动物的早衰问题第四节克隆动物的应用前景第一节哺乳动物克隆的发展历史同种胚胎细胞克隆同种体细胞克隆异种体细胞克隆克隆动物技术的发展已经历了60余年的漫长探索，根据供体细胞核与去核卵细胞的来源可归纳为3个标志性的发展阶段。1938年，[德]科学家Hans

Spemann最早提出克隆设想。1952年，美国科学家Briggs和King将发育后期的青蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中，没有发育。1965年，中国实验胚胎学家童第周完成了金鱼核移植并获得成功。1981年，Illmensee和Hoppe用小鼠胚胎细胞第一次获得了克隆小鼠，但其实验未能被重复。第一个阶段同种胚胎细胞克隆1984年，丹麦科学家Willadsen用胚胎细胞克隆羊获得成功。1990年，中国科学院发育生物学研究所杜淼获得了克隆兔。随后，90年代，中国科学家利用胚胎细胞相继克隆成了兔、羊、猪、牛、小鼠等几种动物。1993年，美国的First用牛内细胞团细胞成功地获得了克隆牛。1997年，中国学者孟励在美国成功获得克隆猴。

至此，国内外动物克隆采用的均为胚胎细胞。1997年，孟励首次用胚胎细胞获得的克隆猴。1997年，英国罗斯林研究所I.Wilmut等宣布用成年羊乳腺细胞首次获得克隆羊。1998年，日本科学家Kato等用牛的输卵管细胞得到克隆牛。第二个阶段同种体细胞克隆1998年，美国夏威夷大学的Yanagimachi等用克隆鼠的卵丘细胞核作供体，获得了克隆再克隆小鼠。至此，同种体细胞克隆进入成熟阶段。1998年，新西兰成功地克隆了奶牛，并克隆了世界上仅存的最后一头珍稀牛。附：同种体细胞克隆研究现状1999年10月和2000年5月，我国扬州大学与中科院发育所合作用携带外源基因的体细胞克隆出转基因山羊。2000年6月，我国西北农业大学用体细胞克隆出山羊。2000年9月，美国科学家采用原核互换的两步核移植方法获世界首例克隆猪。2001年1月，美国麻省ATC公司克隆出一只印度野牛。2002年初，世界上第一只克隆猫在美国诞生。2002年，世界上第一只克隆兔在法国诞生。2003年5月，世界上第一只克隆骡子在美国诞生。2003年8月，世界上第一只克隆马在意大利诞生。2002年初，我国首批成年体细胞克隆牛群体诞生。2002年初，在美国诞生的世界上第一只克隆猫。2002年，在法国诞生的世界上第一只克隆兔。2003年5月，在美国诞生的世界上第一只克隆骡子。2003年8月，在意大利诞生的世界上第一只克隆马。2002年初，在我国诞生的首批成年体细胞克隆牛。1998年～1999年，美国人White用珍稀动物盘羊的体细胞核与牛卵结合，韩国黄禹锡将白头山老虎体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将大熊猫体细胞核与兔卵结合，均成功克隆出早期胚胎。

2001年10月,意大利科学家报道异种克隆濒危的欧洲盘羊获得成功。第三个阶段异种体细胞克隆第二节哺乳动物克隆的技术方法克隆动物主要方法：胚胎分割胚胎细胞核移植体细胞核移植连续细胞核移植优质动物体细胞的来源动物卵母细胞的成熟培养重构胚胚胎移植克隆动物检测体细胞核移植法克隆动物的大体操作流程卵母细胞核体细胞核核移植体外培养1、动物体细胞的体外培养G0期(细胞周期时相)常规体外培养降低血清使用量细胞分裂停止移核前卵丘—卵母细胞复合体(COC)用M199洗3次100μl成熟培养液成熟培养液：

M199+10%FCS+10μg/mLPMSG+10μg/mLHCG5%CO2，38.5℃，饱和湿度24h或28～30h观察卵丘扩展情况例:小牛卵母细胞的成熟培养养(IVM)2、卵母细胞的成熟培养盲吸法荧光法挤压法吸引法蔗糖法3、去核方法带下注射直接胞质内注射法4、核注射方法透明带应用piezo-pulse设备直接注射法常规法原核互换两步法孤雌活化协同法诱导法5、核移植方法将数枚重构胚放入100μL的胚胎培养液（CR1-aa）中培养48h后，选择4细胞以上的胚胎移入铺满饲养层细胞

的培养液滴中。在120h半换液，148h加入1mg/mL的葡萄糖。以后每隔48h半换液。5、重构胚胎的体外培养小鼠胎儿成纤维细胞6、胚胎移植方法假孕的同步发情的寄母输卵管内移植子宫角移植体细胞核卵母细胞重构胚移入同步发情的动物输卵管或子宫内体体体细胞克隆动物研究路线图图图体外培养去核胚胎移植移核7、克隆动物的检测方法微卫星图谱法同工酶法克隆牛“动动”的微卫星检测结果(红色代表标准分子量，蓝色和绿色代表扩增片段)受胎率低（26.2%）流产率高(53.8%)克隆动物的存活率低（35.7%)常出现早衰现象存在问题第三节克隆动物的衰老问题克隆羊“多莉”出现了早衰现象，其端粒长度比正常出生的羊短了20%，这与供核羊FinnDorset的6岁年龄直接相关。人类染色体端粒的荧光免疫原位杂交照片1999年，美籍华人杨向中教授第一个报道了克隆动物具有正常长度的端粒和遗传年龄，得出克隆动物不会未老先衰、克隆动物的遗传年龄与供体动物年龄无关的结论。此后，这一结论被美国麻省的ATC公司在克隆牛上和美国洛克菲勒大学在克隆鼠上得到证实。总之，由于细胞衰老的分子机理至今仍未能研究清楚，因此有关克隆动物的衰老问题，目前仍在争论中，还需要进一步的研究来证实。端粒酶结构的模式图解第四节克隆动物的应用前景克隆动物在畜牧业和医学方面具有极为重要的意义，这不仅表现在理论研究方面，更重要的是其在应用开发方面的实用价值。1.克隆技术能快速培育出大量的优良品种家畜，而用传统的有性生殖方式培育动物良种不但需要花费很长的时间，而且优良性状难以在后代得到控制。克隆动物在畜牧业和医学方面的意义体现在：2.克隆动物的遗传背景完全一致，因而可以避免动物实验的背景干扰，如用在药物检测上，所得结果将更加稳定可靠。3.动物克隆技术可以用来保护濒危动物，用濒危动物的冷冻细胞随时可以克隆出新的成体动物，而无须耗费大量的人力物力。克隆动物可为需要组织器官移植的病人提供所需要的组织器官。

国外已经开始了这方面的研究，例如科罗拉多大学的研究者用来源于克隆牛胎儿的多巴胺生成细胞治疗帕金森氏病模型大鼠，已取得一定效果。治疗性克隆示意图5、动物克隆技术如果与转基因动物技术结合起来将具有更大的发展潜力。转基因动物克隆技术有性繁殖方式需要几代才能获得稳定表达外源基因的转基因动物，而通过转基因克隆动物的方式，很快便可获得新的转基因动物，从而提高转基因动物生产效率。治疗性克隆动物模型器官移植濒危动物转基因动物乳腺生物反应器基础研究遗传育种克隆

细胞拆合真核细胞是由细胞核和细胞质两大部分组成的，细胞的正常生命活动都是在这两部分密切配合下进行的，两部分间有一定的相互关系，为了探明这种相互关系的机理，学者们创建了细胞拆合技术。物理法化学法根据使用方法的不同，细胞拆合可以分为以下两种类型：所谓细胞拆合，就是把核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。第一节

物理法

最早使用的核质分离技术是用机械的方法或短波光把细胞核去掉。例如用微玻璃针或微吸管将原生动物或鱼类、两栖类甚至哺乳动物的卵母细胞的细胞核去掉。还可使用紫外线或激光把细胞核破坏掉,形成去核的胞质体，然后用微吸管吸入其它细胞核，组成新的杂交细胞，进行培养实验。核移植操作示意图核移植操作流程图两栖类的核移植第二节

化学法细胞松弛素B(cytochalasinB)有破坏微丝的作用。1967年Carter发现，细胞松弛素B能诱发体外培养的小鼠细胞排核。至20世纪70年代初，Prescott用细胞松弛素B处理哺乳类细胞，并结合离心技术，可将细胞分拆为核体(karyoplast)和胞质体(cytoplast)两部分。利用这种方法所得的胞质体，纯度可达90％以上，一次处理可获得较大量的胞质体。由于核体外表包有1层细胞膜和少量胞浆，因而也称为小细胞(minicell)。在PEG或仙台病毒的介导下，核体可同另一胞质体融合，形成重组细胞(reconstitutedcell)。重组细胞亦能合成RNA和进行细胞分裂。为了把重组细胞与未去核的细胞区别开来，应先进行标记。将准备制取核体的细胞，用3H-嘧啶核苷标记核；而准备制取胞质体的细胞用小乳胶粒(Φ0.5μm)标记细胞质(乳胶粒可被吞噬进入细胞质)。真正融合的重组细胞，核为3H标记，细胞质中含有乳胶粒。大体操作流程细胞（制取核体用）细胞（制取胞质体用）3H-嘧啶核苷标记————小乳胶粒标记杂交细胞细胞松弛素B细胞松弛素B离心离心核体胞质体融合细胞器的装配

细胞器的拆合是离体的装配过程。第三节

细胞拆合工程的内容线粒体的装配细胞膜的装配细胞拆合工程包括3个方面的内容：

细胞的装配

利用显微操作器进行细胞各部分的解剖，细胞各部分物质的抽取和移植、注入各物质、测量微电位的变化等。

细胞质杂种细胞的研究胞质杂种细胞是深入研究细胞质作用的重要样品，是不同种系之间的一种真正的新型细胞，在适宜条件下能成功地生存下去。在植物中已有烟草的细胞质杂种个体。

1950年，美国科学家RobertBriggs和同事ThomasKing从豹蛙胚胎中取出一个细胞，用玻璃微针管取出其中的细胞核，再成功地将之注入到去核的卵细胞中。

两年后，两人完善了移植技术，在豹蛙的一系列实验中40%的重组卵发育成胚胎、蝌蚪和幼蛙，这是人类第一次培养出的细胞核移植蛙，即克隆蛙。他们的研究结果发表在1952年3月出版的美国《国家科学院院刊》上。

童第周：《鱼类细胞核移植》《鲤鱼细胞核和鲫鱼细胞质配合而成的核质杂种鱼》

1981年，中国科学院水生生物研究所陈宏溪领导的研究小组把成年三倍体鲫鱼的肾脏细胞核移植到二倍体鲫鱼的去核卵子里获得了三倍体的克隆鱼并发育成成体，证明成年鱼的体细胞也可以去分化和再程序化，具有发育成个体的全能性。研究论文发表在1986年的《水生学报》上，这是世界上第一次报道的体细胞克隆动物。1.1963年童第周等首先报道，在鱼类中建立胚胎“细胞核移植”即“克隆”技术。2.1972年童第周等首先报道，在鱼类中获得了“核质杂种克隆鱼幼鱼”。中国的克隆鱼3.1980年童第周等首先报道，在鱼类中获得了“核质杂种克隆鱼”。草鱼核—武昌鱼去核卵获得的“核质杂种克隆鱼”武昌鱼第一代移核鱼草鱼第二代移核鱼4、1982年，中科院海洋所吴尚勤等报道用金鱼的红血球核移到去核金鱼卵內获得了克隆鱼成体。（此实验未重复）5、1986年，武汉中科院水生所陈宏溪等报道用培养的鲫鱼肾细胞核移到鲫鱼去核卵內获得了克隆鱼成体。(此实验未重复)6、1996年，沙市中国水产科学院长江水产研究所余来宁等报道用培养的草鱼肝细胞核移到草鱼未去核卵內获得了克隆鱼成体。（此实验未重复）

这种去核和移核手术很精细，必须在显微镜下用显微操纵仪进行操作，因而选用的材料有一定局限性，一些较小的体细胞，用这种移核方法很难奏效。细胞拆合技术在基础研究方面是一种很有用的手段，利用这种手段证明了细胞核的核酸合成方式和基因表达受细胞质物质的影响。例如，不产生白蛋白的小鼠淋巴细胞同能分泌白蛋白的大鼠肝癌细胞融合所组成的杂交细胞，既能产生大鼠白蛋白，也能产生小鼠白蛋白。

细胞培养动物细胞培养是动物细胞工程的一项基本技术，它是细胞融合、细胞拆合、细胞凋亡、染色体导入和基因转移等项研究的技术基础，同时体外培养细胞也是医学研究尤其是肿瘤学研究的极其重要的材料。原代培养：由体内直接取出组织或细胞进行培养。原代培养的最大优点是：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。最常用的原代培养方法有组织块培养和分散细胞培养。

继代培养（传代培养）：将原代细胞分散后继续在培养基中进行培养。传代代数细胞的世代（增殖代数）

区分:一、动物细胞原代培养的启动三、培养动物细胞的同步化方法二、动物细胞系的建立技术讲授提纲四、动物细胞的冷冻保存技术一、动物细胞原代培养的启动建立一个体外研究体系和实验平台——用于理论及应用研究（如育种等）;建立细胞系——用于功能产品的开发（如药物、材料等）。目的：对动物细胞原代培养的关键主要集中在培养组织的选择、培养基的选择与优化、培养条件的优化、添加物（包括营养成分与生长因子等）的筛选，以及细胞的转化技术等几个方面。（一）最适培养组织的筛选要想成功地进行动物细胞培养，作为组织来源的动物个体，一定要健康无毒。一般说来，作为组织来源的动物越年轻，其细胞相对就越幼稚，仍然保持有较强的分裂能力，细胞培养成功的可能性就越大。因此，动物的胚胎或幼体应是起始细胞培养的最佳材料，故选择细胞培养用组织的一般原则是尽可能选用胚胎组织或幼小个体的器官进行培养。（二）最佳培养基的选择与优化要想成功地进行动物细胞培养，除确定最佳组织来源外，首先必须确定细胞培养的最适营养液，主要包括培养基的成分、类型及所需补充的营养成分。1.基本培养基的选择RPMI1640 MEM DMEM M199F-12 ACM L-15 GIMDM TC-100 ……常用的培养基：2.培养用血清的选择胎牛血清(FBS)马血清(HS)新生牛血清(NBS)小牛血清(BCS)无血清培养动物细胞培养中，为了模仿体内环境条件，利于细胞代谢生长，细胞培养液中通常要加入5-15％的动物或人的血清，由于血清来源有限、价格高、且血清成分复杂难测，每一批血清的成分都有可能不同，这使大量细胞培养受到了限制，培养条件也难以保持完全一致。因此近年来又出现了一种新的细胞培养方法——无血清培养，即在基础培养基中添加各种促细胞生长因子、激素等，取代血清，以使培养基成分更加明确。3.其它补充营养成分的选择除补充血清外，还要考虑添加一些其它的营养成分。这些营养成分包括碳水化合物、氨基酸、维生素和生长因子等。许多学者的研究表明，适量的葡萄糖、氨基酸、维生素C对动物细胞的培养也是必需的。在正常培养条件下，细胞的生长、增殖、分裂与代谢需要添加适量的生长因子。根据目前的研究结果，能促进动物细胞生长和分裂的有EGF、bFGF、TGF-

、IGF

、PDGF、NGF……

添加葡萄糖的培养液有助于细胞的贴壁和生长。1.培养液的pH值2.培养液的渗透压3.培养温度渗透压 细胞形态结构 生长分裂pH值 代谢 细胞生长 分裂温度 代谢 细胞生长 分裂（三）最佳培养条件的确立贴壁细胞所覆盖的培养容器表面积的百分比与细胞外形是评价细胞培养成功与否的重要指标。

原代培养成功启动后，细胞开始分裂并逐渐长成单层（Monolayer），此时便要准备传代培养。传代培养时，要根据细胞的分裂速度和数量决定细胞的传代瓶数（或1传3，或1传2，或2传3

）和换液量（或全换液，或半换液）。一、动物细胞原代培养的启动三、培养动物细胞的同步化方法二、动物细胞系的建立技术讲授提纲四、动物细胞的冷冻保存技术二、动物细胞系的建立技术通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或系，我国业已建立了上百个细胞系，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。正常组织的初级培养物，在传代培养过程中，细胞的寿命有一定的限度，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而成为具有癌性的细胞。建立细胞系的关键就是要千方百计地使培养细胞发生转化，即用某种因子刺激正常细胞发生突变而具有癌性。目前，使正常培养细胞发生转化的刺激因子主要有三大类：物理因子、化学因子和生物因子。（一）物理因子能使培养细胞发生转化的物理因子主要是指一些电离辐射：放射性同位素的射线：60Co、14C、131I、32P、3H……X-rayUVlight物理致癌剂（二）化学因子对细胞具有转化作用的化学因子达数千种之多，其中有无机物，也有有机物。无机物：砷、石棉、铬化合物、镍化合物、镉化合物……有机物：苯、联苯胺、杂环烃、煤焦油、黄曲霉素(aflatoxin)、亚硝胺、烟碱(nicotine)……化学致癌剂（三）生物因子对细胞具有转化作用的生物因子为肿瘤病毒(tumorvirus)，又称致癌病毒(oncogenicvirus)。现已发现有许多种病毒可引起动物或植物发生肿瘤。肿瘤病毒中有DNA病毒，也有RNA病毒。Rous肉瘤病毒(Roussarcomavirus)：一种RNA病毒，其基因组中含有一个癌基因src，其编码产物为具有蛋白质激酶活性的pp60src蛋白，可使许多蛋白质磷酸化，通过级联反应，诱发细胞癌变。pp60src蛋白是一种膜蛋白，结合在质膜的内表面，它可催化磷酸根转移到一些蛋白质的Tyr残基上，使磷酸化Tyr在细胞中的含量提高了10倍。Rous肉瘤病毒(Roussarcomavirus)srcpp60src蛋白(Src蛋白,Tyr激酶)PTyr蛋白质磷酸化细胞癌变无活性pp60srcRSV病毒中v-src基因的致癌机制图解质膜跨膜受体蛋白细胞外配体活性pp60src质膜跨膜受体蛋白磷酸化Tyr有两种作用：一是使细胞的正常调节机制失调，细胞增殖失去控制；二是使细胞的粘着性丧失，易于发生扩散和转移。SV40（simianvacuolatingvirus40）细胞增殖被阻断无活性细胞增殖因子(E2F)(基因调节蛋白)Rb蛋白(封闭细胞增殖因子)p53蛋白(关闭细胞增殖开关)同抑癌基因产物-Rb蛋白和p53蛋白结合，使它们失活，从而使细胞发生癌变p53蛋白Rb蛋白活性细胞增殖因子基因转录T抗原(封闭Rb和p53蛋白)DNA病毒激活细胞增殖SV40病毒T抗原的致癌机理图解——T抗原（T-antigen）：具有转化作用SV40感染虽然动物细胞在培养皿、培养瓶、培养板中均可生长，但在体外利用培养罐进行大量培养就不象培养细菌和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。目前这一问题已经解决，人们在微生物培养用的发酵罐的基础上研制出一种用于哺乳动物细胞培养的反应罐，用以大量培养悬浮细胞（1个振动搅拌器：可以使细胞得到充足的营养和氧气）。附：转化动物细胞的规模化培养一、动物细胞原代培养的启动三、培养动物细胞的同步化方法二、动物细胞系的建立技术讲授提纲四、动物细胞的冷冻保存技术细胞分裂的同步化，对研究细胞周期和染色体标本制作等是非常有用的。只有使细胞周期同步化，获得大量同周期阶段的细胞，才有可能对一定周期阶段的细胞进行状态和生化分析。只有使细胞周期同步化，才能获得大量同步分裂的细胞，如利用秋水仙素处理得到大量中期染色体，以便进行染色体组型、核酸原位杂交及FISH等研究。三、培养动物细胞的同步化方法细胞周期同步化的方法大致可分为3大类：一、分选二、化学同步化三、物理同步化这一类方法是把处于同一周期阶段的细胞挑选出来，加以集中。最简单的方法是用微吸管在显微镜下手工挑选中期细胞。如果用专门的电子装置挑选，每秒钟可挑出1000个细胞。但要快速取得大量同步细胞，则要使用其它方法如过滤、蔗糖梯度离心和膜淘洗等。一、分选1.过滤：将细胞培养物用多层滤膜过滤，小细胞首先通过，集中起来进行同步分裂。此法常用于微生物的分选。2.蔗糖梯度离心：混合细胞悬液经密度梯度离心后，小细胞集中在蔗糖梯度的顶部，搜集起来便可进行同步培养。酵母和哺乳动物细胞培养物可用此法同步化分选。3.膜淘洗：把细胞培养物先结合到滤膜上，再用温热的培养液连续缓慢流经倒置滤膜，新形成的子细胞被冲洗下来，将在短时间内冲洗下来的细胞集中则成为高度同步的细胞。如果滤膜够大，即可得到大量同步化细胞。一种办法是将培养液中减少某种细胞必需的营养成分，过一段时间后再把该成分加进去，以达到同步化的目的。二、化学同步化

另一种办法是使用某种化学物质将细胞暂时阻滞到有丝分裂的一定时期。大肠杆菌T-15秋水仙素、高压氧化亚氮(nitrusoxide)、胸腺嘧啶核苷阻断剂、长春花碱1.温度——细胞同步化的有效手段由于分裂前细胞中的一些酶对温度非常敏感，高温可使分裂停止,而生物合成继续进行，因此有些细胞发生分裂的时间推迟，其它后进的细胞便趁此赶上来，达到同步化状态。

Zeutnen和Scherbaum(1954年)发现，将四膜虫(Tetrahymena)在29.5℃(最适温度)与34℃(抑制温度)两种温度下每30min进行交替培养，经7次循环之后，再于24℃下培养，结果有85%的细胞发生了同步分裂。三、物理同步化2.辐射——引起细胞同步分裂的方法之一

分裂前的细胞对射线很敏感，辐射可使细胞在分裂前积累,随后去除辐射，细胞便在同一时间开始分裂。3.有丝分裂抖落法——哺乳动物细胞同步分裂的常用方法有丝分裂抖落法(mitoticshaking-off)的原理是，处于有丝分裂阶段的细胞外形变圆，附着力降低，因此经震抖后很易从附着的表面上脱落下来；而处于其它阶段的细胞因呈伸展状而附着力强，故不易被抖落，故通过震抖可将处于分裂期的细胞收集起来。细胞周期的同步化只是暂时性的，经过几代分裂之后，细胞群又会处于周期不同步状态。一、动物细胞原代培养的启动三、培养动物细胞的同步化方法二、动物细胞系的建立技术讲授提纲四、动物细胞的冷冻保存技术四、动物细胞的冷冻保存技术由于生物细胞、组织器官甚至胚胎和个体在超低温（-196℃）状态下代谢完全停止，生命处于“静止”状态，故能得以长期保存。冷冻保存技术就是以此为理论基础、以液氮为冷冻剂对生物材料进行长期保存的技术。冷冻保存对于动物种质保存、遗传多样性保护以及动物育种研究等具有重要的理论意义和应用价值。（一）动物细胞的冻存技术冷冻保护剂及其浓度的选择冷冻时细胞所处的生理状态降温速率冷冻保存温度复苏速率影响动物细胞冷冻保存效率的主要因子包括：冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，但对细胞一般均有毒性作用。1、冷冻保护剂的选择冷冻保护剂按其能否渗透到细胞内可分为两种：渗透型冷冻保护剂非渗透型冷冻保护剂甘油、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇等常用的渗透型抗冻剂有：甘油、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等。渗透型冷冻保护剂：多属于低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到了保护细胞的目的。非渗透型抗冻剂：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，即可在特定温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用。常用的非渗透型抗冻剂有乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇等。最常用的冷冻保护剂为二甲基亚砜；有时也经常使用乙二醇、甲醇、甘油、甲醛、蔗糖等。由于每个物种甚至同一个物种的不同发育阶段其最适冷冻保护剂不尽相同，因此，在使用冷冻保护剂时，常常单独选择使用某一种冷冻保护剂或某几种冷冻保护剂混合使用。如：鲤鱼不同胚胎发育时期的最适冷冻保护剂不同：桑椹胚时，二甲基亚砜和蔗糖的冷冻保护效果较好；半原肠胚时，二甲基亚砜、蔗糖、甲醇的冷冻保护效果较好；而心跳期胚胎时，甲醇，甘油为较好的冷冻保护剂。再如：斑马鱼胚胎冷冻保存时的最适冷冻保护剂为溶解于0.1M蔗糖中的甲醇，而且甲醇浓度要随温度的变化而变化(0℃时1M；-5℃时2M；-10℃时3M；-15℃5M)。大多数冻存剂都具有一定的毒性，如果让细胞暴露在过高浓度的冻存剂中，会影响细胞的存活。在选用冻存剂时要根据所用实验材料、细胞时期、细胞活性状态等具体对冻存剂及其使用浓度进行筛选和测试，才能达到最佳冻存效果。2、冷冻时细胞所处的生理状态冻存时，细胞所处的生理状态非常关键。如细胞活性非常旺盛，则容易冻存成功，且冻存细胞的存活率高；如细胞活性不旺盛，则不易冻存成功，且冻存细胞的存活率低。冻存时，多选用处于活跃分裂的对数期细胞进行冻存，以保证冻存成功和细胞的高存活率。3、降温速率降温速率也要根据所用实验材料和具体细胞类型等来确定。一般采用的降温程式：缓慢降温(<1oC/min)降温速率过快，在降温过程中则会引起细胞内形成冰晶，刺伤细胞结构，引起细胞死亡。4、冷冻保存温度液氮：-196oC干冰：-100oC超低温冰箱：-86oC——原则上可永久保存——1年左右——半年左右（二）冻存细胞的复苏技术复苏的一般原则：尽可能快速复温复苏是指冻存细胞恢复至常温后细胞仍然保持生物活性和正常的生物功能。细胞复苏的成败，关键在于复苏速率！不同细胞的耐受温度不同，不可机械制定复苏温度。如哺乳动物37oC，鱼类30oC……

细胞融合细胞融合是指2个或2个以上的细胞融合成1个细胞的过程。人工的细胞融合开始于1950s，此后作为一门新兴技术发展非常快，应用范围也极为广泛，不仅同种类细胞间可以融合，种间远缘细胞也能融合。

细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的。在2003年8月出版的《CellResearch》上，一篇论文介绍了上海第二医科大学盛慧珍教授领导的研究小组的研究成果：“那不成人兔杂交了吗？它是人？是兔？还是半人半兔？”——伦理上的普遍质疑他们将一位5岁男孩、两位成年男性的包皮细胞、一位60岁女性面部细胞的细胞核，放入去掉细胞核的新西兰兔卵母细胞中，成功让融合后的细胞发育到胚泡阶段，从而得到胚胎干细胞。细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究，而且在生产实践上还有重要的应用价值，如目前在单克隆抗体的制备、核质关系、体细胞的遗传和发育、新品种的培养、免疫作用、疾病的治疗和性状的改良、潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。其中最突出的就是在制作单克隆抗体方面的应用！第二节

杂交瘤技术与单克隆抗体第三节

细胞融合和动物新品种培育本章讲授提纲第一节

细胞融合的技术方法第一节

细胞融合的技术方法细胞融合(Cellfusion)又称为细胞杂交(Cellhybridization)，现多统称为细胞杂交。同核体(homokaryon)：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞异核体(heterokaryon)：来自不同基因型的杂交细胞根据所用促融剂的不同，细胞融合技术主要可分为四大类：病毒介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术一、病毒介导的细胞融合技术促融剂：麻疹病毒、副流感病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒以及其他一些副粘液科的病毒大体原理：病毒被膜中的糖蛋白含有融合蛋白(fusionprotein),既可介导病毒同宿主细胞融合,又可诱导细胞与细胞融合。操作繁琐；促融效果较好融合蛋白是副粘病毒的两种包膜糖蛋白之一，其主要功能是引起病毒包膜与靶细胞膜或被感染的靶细胞膜之间发生融合。细胞融合过程需要另一种包膜糖蛋白――血凝素-神经氨酸酶的协助。融合蛋白需要和同源性血凝素-神经氨酸酶共同表达才能显示出融合细胞的活性。病毒增殖紫外线灭活稀释细胞悬液细胞融合诱导大体操作流程筛选二、化学介导的细胞融合技术聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)促融剂：大体原理：

一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。操作简便；促融效果好诱导大体操作流程A细胞融合细胞B细胞A/B细胞混合物按一定数量比例混合与细胞混合物充分混匀一定温度、一定时间计数筛选PEG配制：加热溶化，按体积比加入预热至50oC的无血清培养基后混匀，降温至使用温度待用PEG配制PEG(MW1000-4000,40~60%)促融效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大（在实验时常常采用的分子量1000~4000的PEG，浓度一般为40~60%）PEG介导细胞融合效果的影响因素：1.PEG分子量与浓度:融合效果与温度成正比（质膜流动性与温度成正比），为获得最佳融合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度（哺乳动物细胞，一般采用38~40℃）2.PEG的pH值:pH8.0~8.2：融合效果较好3.PEG作用时间:处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大（一般将处理时间限制在1min之内）4.融合温度:三、电击介导的细胞融合技术操作简便、快速/促融效果好/高回收率/对细胞毒性小原理：游离动物细胞或去壁原生质体，在电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化成偶极子，造成细胞间相互连接成点接触状态；然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点处的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，两个点接触细胞逐步发生细胞融合。BioRad电融合仪动物细胞0.6M甘露醇，0.5mMCaC12·2H2080-300V/cm,0.5-1兆赫兹,30-90秒0.5-1.5KV/cm,幅度脉宽25微秒融合细胞诱导大体操作流程筛选电击液悬浮于融合小室的电极间加入至细胞排列成串电泳效应正弦交变电场施加2-3个脉冲电场施加操作例克隆羊的制做方法原理：贴在一起的两个细胞，用高峰值功率密度激光对细胞接触处的质膜进行辐照，质膜发生光击穿，可产生微米量级的微孔，因质膜上的微孔可逆，质膜分子在重组过程中借助细胞连接处小孔的很高的表面曲率而处于高张力状态，导致细胞发生融合。四、激光细胞融合技术激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：（1）能选择任意两个细胞之间进行融合；（2）因仅在两个细胞的接触点照射激光，故作用于细胞的应力和障碍小;（3）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；（4）能适时观察融合过程。第二节

杂交瘤技术与单克隆抗体第三节

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细胞融合的技术方法第二节

杂交瘤技术与单克隆抗体1975年，英国科学家Milstein和Kohler开创了将产生抗体的单个细胞同瘤细胞融合的技术，解决了上述难题。两位学者因此项发明而获得了1984年的诺贝尔医学奖。

动物受到抗原刺激后可发生免疫反应，由B淋巴细胞产生相应的抗体。一种抗原可具有不同的决定簇，故可为针对不同决定簇的多种抗体所识别。例如纯系小鼠，每1种抗原即可为1000—8000种不同的抗体所识别。但在实际工作中只能测出5—6种。1个B淋巴细胞只能产生1种抗体。因此要想获得大量纯一的抗体，就必须使一个B淋巴细胞大量增殖。令人遗憾的是，1个B淋巴细胞在体外培养条件下不能无限大量增殖，因此，试图通过培养1个B淋巴细胞增殖的方法，来制备针对某一特定抗原决定簇的大量单一抗体，是不可能的。而单一抗体无论在理论研究上还是在实验应用上都有重要的价值，因而制作大量的单一抗体是摆在学者面前有待解决的课题。瘤细胞在体外培养条件下可以无限传代，是“永生”的细胞。为了大量制做纯一的单克隆抗体，他们设计的方法是，把小鼠骨髓瘤细胞同经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）在PEG或病毒的介导下发生融合。融合的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性：1)在体外培养条件下或移植到体内可无限增殖，2)分泌抗绵羊红细胞的抗体。Milestein和Kohler所创立的这种杂交瘤技术在免疫学上导致了一场“革命”！学者们纷纷利用这种技术来制造针对不同抗原的高度纯一的单克隆抗体。大体操作流程目的抗原动物免疫B淋巴细胞细胞融合杂交瘤细胞的筛选分泌抗体的杂交瘤细胞的克隆化分泌抗体的杂交瘤细胞克隆杂交瘤细胞的大规模培养骨髓瘤细胞单克隆抗体抗体检测二、杂交瘤技术的关键操作步骤1.动物免疫：目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.特定目标抗原动物免疫脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法常用免疫方法：皮下注射腹腔注射静脉注射免疫途径：“省时”“操作繁琐”抗原用量少，免疫程序短，不加佐剂，所得单克隆抗体的特异性较高等免疫效果稳定；抗原用量多，免疫程序长，需要添加佐剂，易形成优势克隆等常规免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂第3次免疫：抗原第4次免疫：抗原(皮下注射或静脉注射)(皮下注射)(皮下注射)(静脉注射)抗体效价测定2、细胞融合及HAT筛选病毒介导的细胞融合PEG介导的细胞融合电击介导的融合融合激光介导的细胞融合细胞融合方法：细胞悬液的制备与融合(1)脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备

(2)骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备(3)细胞融合：

50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1minDNA的合成途径DNA合成的主要途径DNA合成的应急途径dUMP(orGln)dTMPDNA四氢叶酸二氢叶酸二氢叶酸还原酶氨基喋呤甲基化次黄嘌呤嘌呤核苷酸嘧啶核苷酸胸腺嘧啶HGPRT,hypoxanthine－guaninephosphoribosyltransferase，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶;TK,thymidinekinase，胸腺嘧啶核苷激酶TKHGPRTHAT培养基的筛选在HAT选择培养液中含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，当DNA主要合成途径被氨基喋呤阻断时，具有HGPRT酶和TK酶的细胞便可通过应急途径利用HAT培养液中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成DNA。未融合脾细胞未融合骨髓瘤细胞自身融合的脾细胞自身融合的骨髓瘤细胞杂交瘤细胞(脾细胞/骨髓瘤细胞)存活存活存活死亡死亡脾细胞——HGPRT+和TK+用来制备杂交瘤细胞的骨髓瘤细胞——HGPRT-和TK-短命融合后细胞混合液HAT培养基培养2周正常培养基HT培养基培养1周HAT培养基的筛选程序：杂交瘤细胞融合后的细胞混合液在HAT培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来所筛选出的杂交瘤细胞并非均分泌针对于目的抗原的抗体，还需要把含有分泌抗体杂交瘤细胞的培养孔挑选出来，因此需要进行抗体检测。3、抗体检测简便、快速、敏感;在短时间内能检测大量样品常用方法：酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)双相扩散法要求抗原酶联免疫吸附法(ELISA)第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：4、克隆化在体外培养时分泌抗体的杂交瘤细胞的分裂速度要慢于不分泌抗体的杂交瘤细胞，经过多次传代培养后很容易丢失，故需要及时地把分泌抗体的杂交瘤细胞挑选出来单独培养。常用克隆化方法：有限稀释法软琼脂平板法显微挑拣法80个细胞/96孔饲养细胞(feedercells)ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的高度纯一的抗体，只针对于一个抗原决定簇——单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)单克隆抗体优点：

高度纯一高度专一5、大规模培养——批量生产单克隆抗体的途径常用的大规模培养方法：动物接种法转瓶培养法反应器培养法培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体动物免疫细胞融合混合细胞的HAT筛选)分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天后细胞死亡无限生长细胞分泌X抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c杂交瘤技术操作流程图解应用：疾病的诊断和治疗(生物导弹)生物大分子的分类、鉴定、定位和分离纯化细胞器的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离产生T淋巴细胞杂交瘤生产均一的淋巴因子研究生产其它细胞分泌产物单克隆抗体-药物的结合物T细胞性的淋巴瘤或胸腺瘤同T淋巴细胞的融合第二节

杂交瘤技术与单克隆抗体第三节

细胞融合和动物新品种培育本章讲授提纲第一节

细胞融合的技术方法第三节

细胞融合和动物新品种培育细胞融合技术是首先在动物细胞中实验成功的，此后在动物细胞中最成功的应用是单克隆抗体杂交瘤技术，而动物细胞杂交技术则还主要应用于核质关系等理论研究和克隆动物的制作中。所谓动物细胞杂交，实际上也是以细胞融合为基础的，即利用人工的方法把分离的不同品种或不同种的动物细胞诱导成融合细胞，然后再经体外培养、分化、植回体内等操作生产杂种动物的过程。获得杂种动物的大体技术路线目标动物1目标动物2靶细胞靶细胞细胞融合杂交细胞的筛选体外培养囊胚植入养母体内杂种筛选与鉴定动物幼体克隆牛的制做过程细胞融合去核尽管动物细胞融合技术已经非常成熟，但由于动物细胞核融合过程中双亲的染色体不亲和性问题非常严重，两种动物细胞融合后出现染色体的排斥与丢失现象十分普遍，且丢失几乎是随机性的，因此要筛选出理想的杂种动物非常困难。一般来说，两种动物的亲缘关系越远，其染色体排斥和丢失现象就越严重。可见，要获得理想的杂种动物，仅仅依靠两种动物细胞的直接杂交是很困难的，这就需要在研究思路上加以开拓和创新。目前，在获得理想杂种动物方面，主要创建了核移植与动物克隆等的技术和方法，而且已经有了较多运用成功的例子，如克隆鱼、克隆蛙、克隆羊、克隆猪、克隆猴、克隆牛等。克隆兔克隆猫克隆猴克隆猪创新应用例多莉羊与寄母克隆马克隆骡子体细胞克隆牛

转基因技术转基因技术是把已知基因转移到真核细胞，并整合到基因组中得到稳定表达的技术。是改变物种遗传性状的最根本途径。转基因技术是1980s初兴起的一项生物高技术，1980年，Gordon将克隆的外源基因导入小鼠受精卵的雄原核中，率先获得了转基因动物。目前，转基因技术在动、植物方面都有开展，而且正以强劲的势头在发展。通过人工操作的方式，将外源基因整合到动物的基因组内，使该动物能稳定地将此基因遗传给后代的实验技术就称为转基因动物技术。

转基因动物最早最成功的例子是“超级小鼠”（supermouse）的诞生。1982年底美国四个实验室报导，将大白鼠生长激素的结构基因GH与金属硫蛋白基因MT-1的启动子拼接在一起，组成杂交基因MGH。然后把克隆化MGH基因用显微注射器注入到小鼠受精卵原核内，将受精卵再移植到假孕母鼠体内发育，结果得到了7只带有MGH基因的小鼠，其中6只显著大于同窝小鼠。这些小鼠生长快，74天时的体重即接近同窝正常小鼠的两倍。有的超级小鼠血清中的生长激素（GH）水平竟达正常小鼠的100—800倍。这一成果的意义在于不仅为遗传工程和遗传疾病的研究提供了模型，而且也为加速经济动物的生长提供了新的技术途径。一、转基因动物的制作过程二、转基因动物的技术方法三、转基因动物的理论和实践意义讲授提纲转基因动物技术是一项复杂而且涉及内容广泛的技术，其制作过程大致如下：1、目的基因的获得、克隆与重组一、转基因动物的制作过程2、目的基因的导入3、目的基因整合与表达的检测利用限制性内切酶获取目的基因；利用mRNA反转录出cDNA；人工体外合成DNA片断；PCR法扩增特定基因片断。1、目的基因的获得、克隆与重组（1）目的基因的获得：要把基因转入宿主细胞，首先要把基因克隆化，然后，给目的基因接上适当的启动子进行重组，以使外源基因有效地整合和表达。目前已经得到了若干真核细胞克隆化基因，如

-珠蛋白基因、TK基因等。（2）目的基因的克隆与重组：即基因转移，利用显微操作或其它方法把外源基因注入到动物早期胚胎中，再把胚胎植入到动物子宫内，发育成的个体不仅能表达注入基因决定的性状，而且能把该基因传到第二代。2、外源基因的导入转入的基因一般是随机整合到宿主动物基因组，但并非所有的外源基因都能整合到动物基因组，而整合的基因也并非都能表达。通过显微注射将外源基因导入后，大部分基因在细胞经过几次分裂后就丢失，只有一少部分DNA得以整合。3、外源基因整合与表达的检测因此，需要对转基因动物进行严格的筛选！目前常用的检测手段是利用PCR方法结合Southernblot杂交法来检测外源基因是否整和并表达。只有外源基因整和并表达的动物才是真正的转基因动物。转基因小鼠的制做过程图解在转基因动物制作中，基因转移是影响外源基因整合效率的十分关键的一个步骤，也是技术难度最大的一个步骤，基因转移需要熟练的操作技术和技巧。原核显微注射法逆转录病毒感染胚胎法胚胎干细胞法精子载体法二、转基因动物的技术方法目前，动物转基因的方法已发展成许多种，其中主要方法如下：显微注射法是通过显微操作仪将外源基因直接注射到受精卵的原核中，该法是产生最早且又最为有效的转基因方法，目前使用非常广泛。但原核显微注射法技术难度比较大，不仅需要昂贵的仪器，而且需要一定的操作技巧。1、原核显微注射法基因原核注入显微图像将外源基因重组到DNA病毒或RNA病毒上，再用重组的DNA病毒或RNA病毒去感染着床前后的胚胎，随着病毒基因插入到宿主胚胎基因组中，外源基因也自然整合到胚胎基因组中。逆转录病毒感染胚胎法是近年来兴起的基因转移方法，操作相对简单而且感染后基因的整合效率高。2、逆转录病毒感染胚胎法利用ES细胞被注射到宿主囊胚中可参与胚胎发育形成嵌和体胚胎的特点，首先将外源基因导入ES细胞，再将ES细胞注射到宿主囊胚中，参与宿主发育形成转基因动物。由于目前ES细胞的研究只有小鼠比较成功，所以用ES细胞途径制作的转基因小鼠比较多，而其它如牛羊等大型动物ES细胞研究尚未成熟，无法应用ES细胞途径进行转基因动物制作。3、胚胎干细胞法将成熟的精子与外源DNA进行预培养之后，使精子有能力携带外源基因进入卵子，从而使外源基因整合于宿主基因组中。这种方法具有简单有效的特点。4、精子载体法基因转移除了上述方法以外，又发展起来一些新的方法，如人工酵母染色体(yeastartificialchromosome,YAC)法、电脉冲法等。YAC法是以YAC作为载体进行基因转移，其优点是可以用YAC携带大片段的基因(30～150万bp)。电脉冲法主要用于鱼类转基因研究，因为有些鱼类的卵壳较硬，而且看不清受精卵原核，所以用显微注射法进行转基因比较困难，而将鱼的受精卵放入外源基因溶液内，并施以一定的电脉冲，就可得到一定整合率的转基因鱼。受精卵4-cell囊胚原肠胚转基因动物胚胎干细胞DNA精子DNA显微注射显微注射DNA转染、电转移反转录病毒感染反转录病毒感染电脉冲法YAC法DNADNA卵子精子载体法几种转基因方法及其与受精卵不同发育阶段的关系三、转基因动物的理论和实践意义自从转基因动物技术出现以来，各国政府纷纷投资开展这项工作，现已建立了转基因小鼠和大鼠，转基因兔、猪、牛、羊等。这不仅因为转基因动物具有重要的理论意义，而且还具有实用价值，能够创造巨大的经济效益。基因表达与调控的研究改造动物个体遗传性状抗病转基因动物育种制作人类疾病及遗传病的转基因动物模型肿瘤发生机理研究及肿瘤预防和治疗方面的应用利用转基因动物作为“生物反应器”生产目的蛋白转基因动物的理论和实践意义主要包括以下几个方面：利用外源基因在转基因动物中的特异表达，研究外源基因在动物体内的活动规律，从而弄清真核细胞的基因调控方式。目前，利用转基因动物已进行了组织特异性基因、发育调控基因的表达及增强子的定位研究。1、基因表达与调控的研究主要应用于畜牧业，通过基因转移改变动物的基因型，达到改良动物品种的目的。如转基因的瘦肉型猪、产奶量高的牛等。2、改造动物个体遗传性状先克隆出某种抗病基因，再将此基因转入宿主动物受精卵中，培育出对某种疾病具有抵抗力的转基因动物。这项技术对家禽病的防治很有意义。3、抗病转基因动物育种将产生某些疾病或遗传病的基因作为外源基因转移，构建出人类遗传病的转基因动物模型，用以研究某些疾病或遗传病的致病机理及治疗方法等。目前已经构建的模型有乙型肝炎和高血压转基因动物模型，

-地中海贫血病转基因动物模型是一种遗传病动物模型。4、制作人类疾病及遗传病的转基因动物模型将可能激发肿瘤的基因导入小鼠受精卵中，制作出具有肿瘤倾向的肿瘤转基因动物模型，使人们可以在整体水平上系统地研究不同癌基因在细胞分化、增殖中的作用，同时也为肿瘤药物的测试和筛选提供了良好的实验材料。5、肿瘤发生机理研究及肿瘤预防和治疗方面的应用动物生物反应器(bioreactor)是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。

6、利用转基因动物作为“生物反应器”生产目的蛋白

国际上通常把目的基因在血液循环系统或乳腺中表达的转基因动物称为“动物生物反应器”。其中动物乳腺生物反应器是目前国际上惟一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器。

1987年，美国科学家首先从转基因小鼠的乳汁中获得了治疗急性心肌梗塞最好的溶血栓药物t-PA（组织纤维蛋白溶酶原活化因子）。近几年来，已有数百种产品在小鼠乳腺获得高效表达，其中数种重要医用产品已在大动物乳汁中生产出来，即将投放市场，如山羊乳腺表达抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)、t-PA均达到6g/L，绵羊乳腺表达抗胰蛋白酶（AAT）达到35g/L，家兔乳腺表达葡萄糖苷酶达到10g/L，猪乳腺表达蛋白Ｃ达到1g/L、第八因子（F-Ⅷ）达到3g/L，奶牛乳腺表达乳转铁蛋白达到3.5g/L。

如荷兰Phraming公司制作的转基因牛能生产人乳铁蛋白(lactoferrin)和促红细胞生成素(EPO)，英国爱丁堡PPL公司的转基因羊能生产

l-抗胰蛋白酶等。乳铁蛋白具有提高免疫机能和防止感染的作用，并具有增加铁质的功效。对红细胞的生成有增强作用的体液性因子；增强肌肉抵抗力；有保护神经细胞的作用；可用来治疗视网膜色素变性等采用“乳腺生物反应器”生产药用蛋白是一种全新的生产模式，目前世界各国达到商业开发水平的乳腺分泌的药用蛋白已超过十种，这一技术正成为生物工程领域的重要发展方向。

组织工程TissueEngineering

组织、器官的损伤及功能障碍是危害人类健康的主要因素之一。

仅是美国一年用在组织器官损坏的医疗费用支出，就高达4000亿美元。至于与细胞相关的技术，全球一年的产值约在八百亿美元左右。目前临床常用的治疗组织器官缺损的方法有三种：

自体组织移植

异体、异种组织移植

生物材料组织代用品自体组织移植：在修复病损组织的同时也对正常部位造成了新的创伤，而且当病损组织范围过大时(如身体大面积烧伤)，往往缺乏足够的供区组织进行修复。

异体、异种组织移植：异体、异种移植面临的最主要问题是免疫排斥反应，病人需要终身服用免疫抑制药物，生存质量得不到保证。异种移植存在的另一个问题是，未知的动物病源可能通过器官移植传染给人类，从而对人类的生存安全造成重大威胁。

生物材料组织代用品：应用天然或合成的生物材料植入体内以恢复组织的连续性，替代缺损组织的部分功能。只能部分地恢复缺损组织结构与功能，而且材料植入人体后常常因疲劳而发生老化等现象，时间过长还需要更换。组织工程是指运用工程科学和生命科学的原理和方法，从根本上认识正常和病理的哺乳动物的组织结构与功能关系，并研究生物学替代物以恢复、维持和改进组织功能。

1987年，美国国家科学基金会（NSF）首次提出了组织工程的概念，并明确了组织工程的定义。组织工程学是根据细胞生物学和工程学的原理，将正常的、具有特定生物学活性的人体组织细胞与生物材料相结合，在体外或体内再造组织和器官，以修复或替代人体损伤组织和器官功能的一门科学。2000年美国时代杂志(Times)就将“组织工程(TissueEngineering)”列为21世纪未来十大热门行业的榜首。

通过组织工程构建的组织，不仅能对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代的目的，而且还可以随着身体生长的变化而一同变化。

组织工程目前研究的领域涉及机体的四大基本组织。主要集中在人工软骨、骨、肌腱、皮肤和肝脏。第一节组织工程的主要研究内容正常组织细胞细胞－生物材料复合物组织、器官替代物体外培养扩增生物材料植入体内受损部位生物材料被降解吸收组织工程的基本原理主要方法是：将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上，然后将细胞一生物材料复合物植入体内的受损部位，细胞在生物材料逐渐被肌体降解吸收的过程中，形成在形态和功能上与受损组织和器