草鱼LGP2和HMGB1b在抗GCRV感染过程中的调节机制研究

草鱼LGP2和HMGB1b在抗GCRV感染过程中的调节机制研究维甲酸诱导基因I(retinoicacid-induciblegeneI,RIG-I)样受体(RIG-Ilikereceptors,RLRs)在感知RNA病毒感染和启动抗病毒免疫应答中发挥着重要作用。RIG-I和黑色素瘤分化基因5(melanomadifferentiation-associatedgene,MDA5)是RLR家族两个重要成员,它们负责识别病毒双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)并通过与干扰素β启动子激活因子1(IFN-βpromoterstimulator1,IPS-1)互作和翻译后修饰来引起下游信号活化。但是对于RLR家族第三个成员遗传学和生理学实验室蛋白2(laboratoryofgeneticsandphysiology2,LGP2)来说,因缺少半胱天冬酶富集结构域(caspaserecruitmentdomain,CARD),使得LGP2不能招募信号传导蛋白以引起下游信号的级联放大。到目前为止,关于LGP2的功能是有争议的,因为既有关于其正调控的报道也有关于其负调控的报道。但是对于LGP2发挥两种截然相反的功能的原因尚不清楚。尤其是在鱼类中,目前还没有充足的证据证明LGP2在RLR信号通路中的调节机制。高迁移率族蛋白(high-mobilitygroupboxprotein,HMGB)是一类保守的染色质相关蛋白,也是一类新的核酸识别分子。之前的研究表明,草鱼(Ctenopharyngodonidella)HMGB家族成员在草鱼呼肠弧病毒(grasscarpreovirus,GCRV)感染过程中发挥重要作用。由病毒感染和病原相关分子模式(pathogen-asociatedmolecularpattern,PAMP)刺激引起的HMGB动态亚细胞定位是受HMGB分子内不同结构域间相互作用调控的。然而,对于HMGB在抗病毒免疫中的调节机制尚不清楚。在本研究中,我们对GCRV感染过程中,LGP2在RIG-I和MDA5调节的抗病毒免疫反应中的调节机制进行了研究。同时我们也鉴定了热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)作为HMGB1b的互作蛋白,并证明了HSP70在HMGB1b调节的抗病毒自噬中的正调控作用。1.在静息状态下和GCRV感染早期,LGP2在RIG-I和MDA5调节的抗病毒信号传导中发挥负调控作用在本研究中,我们证明,在静息状态下或病毒感染早期,LGP2过表达抑制了干扰素调节因子(interferonregulatoryfactor,IRF)3和7的蛋白合成和磷酸化水平。同时,LGP2过表达也抑制了所有干扰素(interferon,IFN)家族成员(IFN1、IFN2、IFN3、IFN4、IFNγ1、IFNγ2)和核因子κB(nuclearfactorκB,NF-κB)家族成员(NF-κB1、NF-κB2)的mRNA水平和启动子活性。敲降LGP2之后得到了相反的效应。双荧光素酶报告试验表明,LGP2在RIG-I和MDA5上游发挥作用。同时,LGP2能与RIG-I和MDA5相互作用,并且这种相互作用是不依赖于GCRV感染的。结构域互作试验发现,LGP2与MDA5的三个结构域都互作。但不与RIG-I的CARD结构域互作。此外,LGP2对RIG-I和MDA5的K63连接的泛素化有明显的抑制作用,但对RIG-I和MDA5的CARD结构域来说,LGP2过表达只显著抑制了RIG-I的CARD结构域K63连接的泛素化,而对MDA5CARD结构域的K63链接的泛素化没有影响。这种差异导致了LGP2在RIG-I和MDA5调节的IPS-1和IRF3活化调节因子(mediatorofIRF3activation,MITA)活化中的不同抑制机制。有意思的是,LGP2对RIG-I和MDA5的K48连接的泛素化也有抑制作用。我们推测这种抑制作用保证了RIG-I和MDA5的基础蛋白水平,为随后信号的迅速活化提供了物质基础。以上结果表明,在静息状态下或病毒感染早期,LGP2在RLR信号通路中发挥负调控作用,这是机体维持稳态所必须的。2.GCRV感染后,HSP70通过与HMGB1b互作、引起HMGB1b的胞质转运、以及增强HMGB1b-Beclin1相互作用来促进HMGB1b调节的抗病毒自噬自噬在病理和生理过程中发挥着重要作用。然而,在鱼类中,人们对自噬在应对病毒感染中所扮演的角色及其调控机制的研究却很少。在本研究中,我们发现GCRV感染和双氧水(hydrogenperoxide,H2O2)处理引起了CIK(C.idellakidney,CIK)细胞中活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的积累以及随后的自噬活化。而ROS引起的自噬反过来抑制了病毒复制。进一步的研究表明HMGB1b是一个HSP70依赖的促自噬蛋白。在H2O2处理后,胞质定位的HSP70转运到细胞核并在细胞核中与HMGB1b互作,进而促进了HMGB1b的胞质转运。在胞质中,HSP70与HMGB1b协同增强ROS引起的自噬活化。而且,HSP70通过与Beclin1的直接相互作用来增强HM