辅助生殖科辅助生殖临床技术操作规范

辅助生殖科辅助生殖技术操作规范

目录第一篇辅助生殖临床应用第一章取卵手术 第一节、取卵手术常规 第二节、取卵手术负压吸引器调节程序 第二章．冷冻胚胎移植 第一节、冷冻胚胎移植的内膜准备 第二节、胚胎移植手术 第三节、验孕和孕期监测 第三章．宫腔内人工授精常规 第一节、宫腔内人工授精的必备条件 第二节、宫腔内人工授精的适应症 第三节、宫腔内人工授精的禁忌症 第四节、宫腔内人工授精促排卵常规 第二篇 辅助生殖实验室部分第一章. 精液检查及精子制备第一节、 精液常规检查操作方法第二节、 精子形态分析操作方法第三节、 精子低渗肿胀试验(HOS)第四节、 全自动精子分析系统使用说明(西班牙SCA全自动精液质量分析系统) 第五节、 抗精子抗体(MAR)检测方法第六节、 细针附睾/睾丸穿刺取精术及精子制备常规第七节、 伊红试验第二章. 宫腔内人工授精的实验室处理第一节、 取精第二节、 精液处理第三节、 授精第四节、 文件书写第三章. 体外受精-胚胎移植常规第一节、 仪器准备(最迟提前2天)第二节、 试剂第三节、 所需物品第四节、 步骤第四章. 卵细胞浆内单精子注射常规第一节、 仪器配置及注射前准备第二节、 卵细胞浆内精子注射的适应症第三节、 ICSI操作程序第五章. 卵子辅助激活常规一、卵子辅助激活指征二、激活试剂配制三、步骤第六章. 玻璃化冷冻解冻常规一、冷冻解冻试剂配制二、冷冻操作常规三、解冻操作常规第七章.精子冷冻一、新鲜精子冷冻二、睾丸及附睾精子冷冻第三篇辅助生殖并发症的防治 第一节、取卵术手术并发症及处理第二节、减胎术概述第三节、卵巢过度刺激综合征诊疗常规第四节、异位妊娠诊疗常规第五节、感染的诊疗常规第六节、脏器损伤的诊疗常规第七节、血管损伤的诊疗常规第八节、卵巢扭转的诊疗常规

第一篇辅助生殖临床应用第一章取卵手术技术第一节、取卵手术常规1)精神紧张者可使用杜冷丁镇痛，用法为50mg肌注，注药前病人解小便，若既往注射度冷丁后呕吐严重则禁用。2)打开加热台开关，如果需要冲洗，打开冲洗机，使注射腔预热(见附录)。3)手术者及器械护士洗手，注意擦第二遍灭菌王后用灭菌毛巾准备好所用物品(见附录)。4)进手术室前给病人肌注将手擦干。5)器械护士穿手术衣，戴手套、生理盐水洗手，将14mlFalcon管平放于取卵加热台上，并用无菌巾盖好，使取卵管预温。6)手术者戴手套，打开阴道消毒包,用10ml注射器抽1%利多卡因，放台上备用。7)手术者用PVP碘消毒外阴、阴道，用生理盐水冲洗阴道至碘全部冲尽(纱布不变色)。8)阴道冲洗后用干纱布将阴道擦干，于宫颈基底3点9点处各注射1%利多卡因5ml。注意注药前要回抽，证实未刺入血管后再推药。9)手术者穿手术衣，换干净手套,生理盐水洗手。11)器械护士、手术者、巡回三者协同上阴道探头套及布套,注意无菌操作。12)生理盐水纱布擦洗探头套。13)生理盐水冲洗穿刺架，上穿刺架,作盆腔扫描。14)撕开穿刺针袋，手术护士将穿刺针从袋内取出，立即将取卵管套在胶塞上(注意不可碰触胶塞的内面)。将穿刺针与负压吸引管连接，按负压调节程序调负压至15Kpa。15)若需卵泡冲洗，此时通知实验室将装有冲洗液的60ml注射器递出交巡回与冲洗管连接并安装于冲洗机上。16)管道冲洗：巡回从操作箱内取出冲针液，手术者将穿刺针插入试管中吸出1-2ml冲针液使管道温度及PH平衡，吸出之冲针液连同取卵试管应弃去.若为双腔针可先冲再吸。余下的冲针液应立即放回操作箱.若为含Hepes之冲针液,盖子应盖紧；若为碳酸氢盐缓冲的冲针液,放回操作箱前盖子松开。17)通知实验室，若实验室已做好准备可开始卵泡穿刺。当一侧卵巢卵泡穿刺完毕后应取出穿刺针，经冲洗液冲洗后，将穿刺针插入保护套内，待实验室找卵近结束时再次冲洗取卵针并开始下一侧卵巢的穿刺。18)手术护士应注意手术台温度和取卵管温度，注意负压系统工温度下降太快,应关闭风机或升高室温。19)手术过程中若出血多，可将阴道探头紧压于阴道穹隆数分钟，一般出血会立即停止。20)若卵巢位于子宫上方，可采取以下方法避免经子宫穿刺：腹部按压,改变探头方位，牵拉宫颈。若上述措施无效,可经子宫穿刺，但应避免经过内膜。21)取卵完毕后，常规盆腔扫描并做阴道检查,若有出血做相应处理。22)术者填写《取卵手术记录》。附录：取卵手术物品取卵手术物品1.洗手、消毒物品①洗手用品②阴道消毒包③温生理盐水8瓶④漏斗、塑料桶2只2.消毒巾①塑料布②手术衣、口罩、帽子③消毒手套④孔巾、脚套⑤阴道探头布套3.手术车、消毒车4.穿刺物品①取卵针(16G或17G，根据情况而定)②阴道探头套③吸引管④消毒玻璃接头⑤14毫升FALCON管若干(根据卵泡多少定)⑥16G穿刺支架⑦消毒试管架⑧5毫升注射器，60毫升注射器5.其它①手术灯②吸引器③B超仪④椅子⑤加热台第二节、取卵手术负压吸引器调节程序负压吸引器工作状态好坏对取卵影响很大，取卵术前、术中应注意观察：1)连接负压吸引管前应先试机，当按住进气口(玻璃接头)时负压应上升至15Kpa。开放进气口，再反复试三次。若负压不在15Kpa应调节负压调节旋钮。最大负压达不到15Kpa，可能提示吸引胶管漏气，接头连接不紧或吸引器已损坏，此种情况应调换吸引器。2)将吸引器玻璃接头与吸引管紧密连接，再将吸引管玻璃接头与取卵针连接，取卵针胶塞与取卵管接紧，各接头处不可漏气。3)吸空针(CCD17G单腔针)负压应达到5Kpa，否则表明负压系统有问题，反复试三次。4)吸培养基，负压应接近15Kpa，且培养基呈线状流入取卵管。若负压达15Kpa但培养液不呈线状流入，表明取卵针已不通畅，应换针。5)取卵过程中若穿刺针进入卵泡中很顺利，但卵泡液流出缓慢或卵泡缩小缓慢，表明负压系统有问题或穿刺针阻塞，应立即检查原因，并作相应处理。6)若取卵率低，应首先检查负压吸引系统。7)负压吸引器放在手术台上，取卵过程中巡回；手术护士、手术者应反复观察压力表显示。说明：a、负压吸引器为XX医用吸引器厂生产的羊水吸引器，型号YB-DYX-1。在0-25Kpa内可调另购脚踏开关与吸引器连接，脚踏开关电线长2米。b、压力旋钮平时放强档，使用时旋转微旋钮调节压力。c、使用时去掉负压吸引瓶，吸引器进气管通过盐水接头直接与无菌吸引管连接。d、吸引器进气管(绿色)不耐紫外线，应用胶带保护。冲洗机调节方法：①移动显示条按A②显示移动条内容按B③移动黑方块按A④改数字按数字键⑤输入设定内容按“Enter”⑥使活塞后退再开门一次。

第二章冷冻胚胎移植技术操作规范“以冷冻胚胎移植为核心的IVF策略”不同于传统超排卵周期因卵泡多为防止OHSS或因孕酮高不适合新鲜胚胎移植不得已而采用全胚冷冻。“以冷冻胚胎移植为核心的IVF策略”是主动的全胚冷冻，包含四个基本要素：简单的促排卵方案、全胚冷冻、主要在自然排卵周期进行冷冻胚胎移植、简单的黄体支持。冷冻胚胎移植涉及以下关键问题：内膜准备、胚胎内膜同步、黄体支持。第一节、冷冻胚胎移植的内膜准备冷冻胚胎移植可以在自然周期、微刺激周期和激素替代周期进行，前两种称为有排卵周期。排卵后有黄体形成，移植后黄体支持简单，应该尽量在有排卵周期进行冷冻胚胎移植。一、自然排卵周期内膜准备适用于排卵正常，周期23-30天的妇女。月经周期第10天前排卵的妇女不适合自然周期冷冻胚胎移植，可以用来曲唑推迟排卵2天。周期超过30天的妇女监测时间较长，也可以用来曲唑促排卵，缩短监测次数。准备自然周期冷冻胚胎移植的患者，根据月经周期长短从月经周期第10天-12天开始用尿LH试纸监测，每天一次，用晨尿测定。若LH开始显示，来院抽血查性激素：FSH,LH,E2，P4，同时超声监测，注意内膜厚度、形态、卵泡大小、有无输卵管积水。注意少数妇女LH峰不典型，尿LH测定一直阴性，若LH一直阴性，月经周期第14-15天来院查性激素和超声监测。1、若血LH水平超过10miu/ml，E2超过200pg/ml，且内膜超过8mm，形态正常，卵泡平均直径大于16mm，标志着LH峰已经出现。2、若血LH超过10miu/ml，但小于20miu/l，E2、P4仍低，卵泡平均经线小于15mm，应该第二天复查，判断LH峰是否真正发生。3、若血LH水平低于20mIU/ml,且P4低于1ng/ml,即LH处于上升期，当日夜晚9点注射HCG10000U，+5天上午9-10点解冻D3胚胎，+7天上午9-10点解冻D5-7囊胚4、LH水平等于或大于20mIU/ml,或P4大于等于1ng/ml,即LH峰处于下降期，当日下午2-5点注射HCG10000U，+4天上午9-10点解冻D3胚胎，+6天上午9-10点解冻D5-7D囊胚。5、若已经排卵、P4在1-2ng/ml之间，为排卵第一天，立即注射HCG10000U，同时开始使用达芙通和安琪坦或雪诺酮，+3天上午9-10点解冻D3胚胎，+5天上午9-10点解冻D5-7D囊胚。一般口服达芙通支持黄体已经足够，不再监测内源性孕酮，不注射黄体酮油剂，方便病人。6、夜晚9点注射HCG10000U的，+3天开始口服达芙通下午2-5点注射HCG10000U的，+2天开始口服达芙通(达芙通用量20mgBIDPO)。7、若注射HCG日卵泡平均直径低于15mm，可能发生黄体功能不全，应该加强黄体支持，口服达芙通同时阴道塞黄体酮，如安琪坦0.2gbidpv，或雪诺酮1支pv。8、注射HCG后到移植日不再监测，移植日测内膜，移植后不监测内源性孕酮和雌激素。9、取消移植标准：E2高峰日，或冷冻胚胎移植日内膜厚度低于8mm；E2高峰值低于150pg/ml，LH峰日卵泡小于14mm，或不能确定排卵时间，或内膜形态异常均应该取消移植。二、微刺激周期的内膜准备1、来曲唑微刺激(来曲唑的用量应根据月经周期长短决定)：①周期30--34天，来曲唑第一周期用量2.5mgqd3天。②周期35--40天，来曲唑第一周期用量5mgqd3天。③周期超过40天，来曲唑第一周期用量5mgqd5天。④周期第10天前排卵，或卵泡14mm以下排卵的妇女，可以用来曲唑推迟排卵。来曲唑2.5mgqd3天。来曲唑用量越大需要添加的HMG用量越少，卵泡越少，雌激素越低来曲唑用量越小--需要添加的HMG用量越大，卵泡越多，雌激素越高。一般从月经周期第3天开始口服来曲唑，用药起始日后7天超声监测：主卵泡超过14mm,不需要加用HMG主卵泡不足14mm，加用HMG150uimqod,2-3次复诊2、HMG晚刺激若月经第12天主卵泡小于10mm，用HMG促排卵，HMG150imqod，根据卵泡的大小决定用药次数，促排卵的同时监测尿LH。一般HMG晚刺激周期卵泡在15mm出现LH峰。无论是自然周期还是微刺激周期做内膜准备，均采用严格同步的方法，同步方式和黄体支持同自然周期。三、激素替代周期的内膜准备为减少病人痛苦，尽量不采用激素替代做冷冻胚胎移植，HRT有指证进行。适用于：①FET反复自然周期失败；②.不明原因不孕自然周期FET失败；③自然周期内膜<6mm；④周期<23d、周期第10天前排卵或卵泡<14mm有LH峰出现者；⑤异常出血(排卵期出血、经期延长)的患者。内膜薄、异常出血的患者应该先做宫腔镜，有排卵周期胚胎移植失败的患者、有人工流产史、宫腔手术史、结核史的患者应该先做宫腔镜检查。激素替代前一般不需要降调节，从月经周期第3天直接使用雌激素。子宫肌腺症是否需要在激素替代前作降调节没有确切的证据，如果内膜正常，子宫肌腺症患者在激素替代前没有降调节的必要。为有效抑制卵泡发育，使用乙炔雌二醇25微克tidpo14天，若患者对乙炔雌二醇胃肠道反应严重可以换成芬吗通红色片，4mgbidpo14天。应用雌激素14天后超声监测内膜厚度、形态，注意有无卵泡发育。血激素检查注意孕酮水平，如果孕酮超过1.0n/ml，周期取消。如果内膜厚度达到8mm、孕酮未升高可以考虑使用孕激素转化内膜，或根据工作安排决定开始使用孕激素进行内膜转化的时间。如果使用14天雌激素后内膜达不到8mm，并且无卵泡发育、无孕酮升高，应该延长雌激素使用时间：维持原来的雌激素剂量不变，同时加用芬吗通白色片1mgqnpv,阿司匹林50mgbidpo防止血栓。1mg芬吗通阴道塞药血清雌二醇水平可以达到100-1500pg/ml。特别注意向患者交代在孕激素转化内膜前不可以使用含有地屈孕酮的芬吗通灰色片。激素替代最长可以达到35天，过长时间的雌激素使用内膜突破性出血的可能性大大增加。达到上述使用孕激素转化的标准后，停止使用原来口服的雌激素，口服芬吗通黄色片2片bidpo，同时阴道塞黄体酮(安琪坦0.2gbidpv，或雪诺酮1支pv)，维持原来阴道使用的芬吗通塞药，和阿司匹林。决定内膜转化日，+3天上午9-10点解冻D3胚胎，+5天上午9-10点解冻D5-7D囊胚。不监测外周血孕酮。四、尿LH测定为了提高就诊效率、优化就诊流程，尿LH检测不失为一种辅助医生做出判断和处理的有效手段。通常情况下，采用轻微刺激、人工授精、自然周期等促排卵方案时，因监测频度稍高，为了减少等待时间，采用血激素和尿LH测定相结合的方法，可以提高就诊效率。进行卵泡期非降调节的促排卵或自然周期监测的患者，应常规监测尿LH，开好尿LH试纸后，根据月经周期长短和具体促排卵方案告知患者开始测尿LH的时间和方法。尿LH的检测方法是否正确尤为重要，医护人员应告知患者检测时要看到尿液被吸进观察窗，方能取出，应5分钟后观察，若观察太早不易发现LH峰，容易漏诊，早晚各测1次LH试纸更易发现LH的变化。很多人可能不会出现说明书上提示的强阳性，即T和C线深浅相同，所以要提醒患者不能等强阳就诊，否则会错过排卵时间。医护人员应告知患者复诊当日携带尿LH试纸给主管医生看，以利于主管医生快速做出判断，减少患者在医院的等候时间，提高就诊效率。有关尿LH的具体测试方法和注意事项参看黄体期促排卵章节的有关部分。第二节、胚胎移植手术一、胚胎移植基本原则胚胎移植是影响辅助生殖技术效率的重要环节，胚胎移植技术的好坏直接影响到试管婴儿的成功率，因此参与胚胎移植的实验室和临床工作人员都应重视胚胎移植的规范操作。移植时间：移植时间应根据冷冻胚胎的内膜准备所述的方法进行。1、移植胚胎数：挑选形态最佳的胚胎做移植，移植分裂期胚胎不超过2个，移植囊胚不超过2个。移植胚胎的数量应征求病人的意见，告知多胚胎移植可能发生多胎妊娠。胚胎评价及分级标准见附录。操作要点：移植过程的各个操作应轻柔，努力做到无损伤操作。2、移植前准备：①移植当天早上8点阴道超声检查内膜厚度、有无宫腔积液，若有输卵管积水则在移植前抽掉积水；确认无误通知实验室开始解冻胚胎；②根据当日取卵手术量决定具体移植时间并告知病人，胚胎解冻后谈话签字，向病人交待胚胎移植前需充盈膀胱。③通知实验室具体的胚胎移植时间，以便实验室作相应准备。包括：预温一个4孔培养皿、巴士德管、毛细巴士德管、胚胎移植内管；胚胎移植前日将移植液放培养箱内平衡至少8小时等。④移植前阴、腹B超检查，观察子宫位置、屈度、从宫颈外口到宫腔底部长度、子宫内膜厚度及形态、有无宫腔积液、卵巢大小、有无输卵管积液、有无盆腔积液等。若有宫腔积液则应抽除积液并推迟移植。若有过激表现则取消移植。决定推迟移植或取消移植的病例，临床医生应将决定通知实验室。内膜厚度低于5mm或发生过早LH峰可不做新鲜胚胎移植所有胚胎于原核期进行冷冻保存。二、胚胎移植过程物品：胚胎移植包、胚胎移植管、孔巾、温生理盐水、庆大霉素8万单位、漏斗、带腹部探头的B超。1、阴道准备：患者膀胱截石位上身平卧，术者带无菌手套，生理盐水擦洗外阴后铺孔巾，上窥阴器，生理盐水加庆大霉素擦洗阴道及颈管，注意应可能的将宫颈粘液清除但需避免颈管出血，若宫颈粘液多可用胚胎移植管的外套管插入宫颈管内将粘液吸出(做移植时应使用新的外套管)。2、助手腹部超声做子宫扫描，纵切子宫显示离宫底3CM处即为外套管最深点(TDT管)。3、插外套管：胚胎移植管拆封后移植内管连同其包装袋递交给实验室放胚胎操作箱内保温，外套管交术者，注意拿外套管时术者不可碰触导管前后端。取出外套管内芯在腹部超声引导下将外套管插入到距宫底3cm处，并通知实验室外管已插好，实验室开始装胚胎。若不用内芯插管困难可上宫颈钳牵拉宫颈，重新插管；若仍插管困难加用内芯用无菌纱布包裹移植管外管前端做适当弯曲后插管；若仍很困难可尝试更换窥阴器、腹部按压、改变体位后插管，若仍无效应推迟一天移植，次日移植前口服安定5毫克或在麻醉下移植。4、装胚胎：当临床医生开始做插管前准备时实验室人员做移植准备，打开胚胎实验室内、外门，操作箱充气后将移植液取出，在操作箱内用经过移植液洗涤的巴士德管将移植液吸出加入到四孔培养皿的1-3号孔中，各孔的液体量分别为0.5-0.8ml、0.8ml、0.5ml，将胚胎从培养箱内取出置操作箱内，用经移植液洗涤的毛细巴士德管将待移植的胚胎转移到3号孔中经洗涤后转移到1号孔中，集中放置在9点位置。取一个1mlBD注射器，反复抽拉活塞，去针头将注射器接到胚胎移植管内管上，将内管从保护套内取出，尖端置入2号孔内，上抽注射器活塞将0.3-0.5ml移植液吸入到内管及注射器内，当注射器内液面不在上升时拔出注射器，将注射器直立上推活塞排除气泡，再将注射器与内管接紧，将内管前端再插入2号孔液体中压紧活塞后弹开待管内压力平衡后按下述步骤装胚胎：空气5-7mm、胚胎及移植液7-10mm、空气2-3mm、移植液2mm。注意整个操作过程应遵守无菌操作原则防止移植管内管前端5cm、巴士德管前端10cm、毛细巴士德管1cm接触非无菌区。5、移植：实验室工作人员将已装好胚胎的移植管内管送交临床人员并递送到术者手中，术者应迅速将内管插入到外管中直至内外管前端平齐，在助手腹部超声的引导下将内管前端插入到距宫底0.3cm处，当内管到达指定位置后保持内管位置不变将外管后退双手紧压注射器活塞将胚胎注入宫腔，立即将内外管取出送实验室检查有无胚胎残留。注入胚胎时及退管后应注意观察气泡在宫腔内的位置。6、检查移植管：实验室人员将胚胎移植管内管尖端放置在2号孔液面上，用力压注射器活塞将管内空气排出，然后将尖端插入移植液中来回抽拉注射器活塞并在显微镜下观察有无胚胎流出，同时注意粘液量的多少和血液污染。保持内管尖端在2号孔中将注射器从移植管上取下，注射器活塞上拉，再次将注射器接在内管上，缓慢下推注射器活塞将内管中的液体全部排入到2号孔中，同时在显微镜下观察有无胚胎残留。若有胚胎残留应通知临床医生立即再次移植，再次移植时更换新的胚胎移植管。7、临床医生和实验室人员按照胚胎移植记录单的内容逐项填写移植过程。三、胚胎移植后处理1、移植后病人即可回家。2、移植后嘱患者保持正常的工作和生活状态，不必卧床休息。按照移植前医嘱用药。3、嘱病人移植后14天做尿妊娠试验，若阴性，可过三日再次复查；若妊娠，继续黄体支持，并于二周后复查B超。四、附录—胚胎分级标准1、原核期胚胎分级标准原核分级仅限于双原核受精卵根据：原核的大小、距离、位置；核仁的数量、大小、分布等进行分类：Z1、Z2、Z3、Z4，由Z1-Z4胚胎质量下降。Z1、Z2、Z3具备以下共同特征：两原核大小相称、位于中央两原核靠拢。Z1：双侧原核中核仁数在3-7之间，核仁数相等、大小适中；双侧原核中核仁在两原核交界处排列成线Z2：双侧原核中核仁数在3-7之间，核仁数相等、大小适中；双侧原核中核仁呈散乱分布Z3：双侧原核中核仁数不等、分布方式不同、大小不称Z4：双侧原核未靠拢、原核大小明显不等、原核不在卵中央根据ScottL.HumReprod.15(11)p2394-2403,2000修改2、WIH评分系统细胞分数=细胞数评分+碎片评分+对称评分，分数越少胚胎质量越差。天数分数4分3分2分1分0分D2细胞数4-6212PN碎片程度0%<10%10-25%26-49%>50%裂球对称稍不对称很不对称D3细胞数8-104-510碎片程度0%<10%10-25%26-49%>50%裂球对称稍不对称很不对称3、胚胎分级(由Ⅰ-Ⅳ胚胎质量下降)分级细胞大小细胞形态胞质碎片均匀规则均匀清晰无颗粒0-5%稍不均稍不规则可有颗粒10-20%Ⅲ级明显不均明显不规则明显颗粒21-50%Ⅳ级严重不均严重不规则严重颗粒>50%4、囊胚评分1)、囊胚(blastocyst)发育分期1期:earlyblastocyst囊胚腔小于胚胎总体积的1/22期:blastocyst囊胚腔大于胚胎总体积的1/23期:fullblastocyst囊胚腔完全占据了胚胎的总体积4期:expandedblastocyst囊胚腔完全充满胚胎,胚胎总体积变大,透明带变薄5期:hatchingblastocyst囊胚的一部分从透明带中逸出6期:hatchedblastocyst囊胚全部从透明带中逸出2)、内细胞团(innercellmass)分级A级:细胞数目多,排列紧密B级:细胞数目少,排列松散C级:细胞数目很少三.滋养层细胞(trophectoderm)分级A级:滋养细胞层由较多的细胞组成,结构致密B级:滋养细胞层由不多的细胞组成,结构松散C级:滋养细胞层由稀稀疏疏的细胞组成3)、碎片分型Ⅰ型:少量碎片,且与某一细胞相连Ⅱ型:碎片局限于某一部位,主要位于卵周间隙Ⅲ型:小而分散的碎片,位于分裂腔或卵周Ⅳ型:大颗粒碎片,有的形似细胞,常随机分布并与大小不均的细胞相连Ⅴ型:碎片象坏死性的,伴有完整细胞的特征性的颗粒与胞浆收缩第三节、验孕和孕期监测移植后14天查血看是否怀孕。若怀孕，维持原来用药不变，14天超声检查，特别注意孕囊数、孕囊位置、是否有宫内外混合妊娠、是否有单卵双胎。若有疑问，3-7天复查。若宫内妊娠诊断无疑问，维持原来用药一个月再作超声检查。第二次超声检查如果正常，停止黄体支持。

第三章宫腔内人工授精技术操作规范将精液经过处理去精浆后将精子送入女方子宫中，称为宫腔内人工授精(IUI)，分为夫精人工授精(AIH)和供精人工授精(AID)，前者使用的是女方丈夫的精子，而后者使用的精子由供精者提供，不是其丈夫。AIH一般使用新鲜精液，而AID使用的是冷冻精液。第一节、宫腔内人工授精的必备条件宫腔内人工授精要求女方至少有一根输卵管完全畅通，且无影响输卵管拾卵功能的卵巢—输卵管粘连，同时要求精液中至少有1000万条前向运动的精子，前向运动精子总数不足1000万条应做体外受精或卵细胞浆精子注射。输卵管通畅性的检查方法详见本科的“超声输卵管盆腔显影术操作常规”。第二节、宫腔内人工授精的适应症1．夫精宫腔内人工授精主要对象为：轻度的少弱精症经治疗无效(至少有1000万条前向运动精子)不明原因的不孕症单纯排卵障碍经促排卵治疗半年未孕免疫性不孕症宫颈因素的不孕症性交障碍(逆行射精、不射精、阳痿)盆腔粘连行输卵管卵巢粘连分离术，术后证实盆腔无粘连且输卵管通畅但经半年不孕第三节、宫腔内人工授精的禁忌症人工授精的先决条件是至少有一侧输卵管正常且有适当数量的精子，因此下列患者不适宜做宫腔内人工授精：1.卵巢早衰2.不能耐受妊娠负担3.严重输卵管损害4.严重盆腔粘连5.严重子宫内膜损害6.双侧输卵管阻塞7.夫精人工授精者丈夫精液中前向运动精子数低于1000万条者人工授精妊娠的可能性很小，应改做体外受精或卵细胞浆内精子注射8.男女急性生殖道感染未治愈者9.不能耐受妊娠负担或患有不适宜妊娠的疾病10.不符合计划生育政策者第四节、宫腔内人工授精促排卵常规宫腔内人工授精可以在自然周期、促排卵周期进行，为防止多胎和OHSS应强调轻微刺激。有证据表明不明原因的不孕症患者在促排卵周期的妊娠率高于自然周期一、自然周期人工授精排卵正常的妇女可以在自然周期人工授精，根据月经周期长短，自月经周期第10-12天开始监测尿LH(参考冷冻胚胎移植内膜准备-自然周期章节)，尿LH阳性来院查性激素和超声检查、白带检查，根据激素检查结果，预测排卵时间，如果预测排卵时间在第二天上午前，应在当天下午做AIH(参见自然周期紧急取卵章节)，如果预测的排卵时间在第二天，应该在第二天上午行AIH。AIH不需要严格的时间，排卵前或排卵后都可以。一次AIH即可。鼓励AIH患者保持正常的性生活，特别是临近排卵期性生活更加重要。二、微刺激促排卵月经周期正常的妇女，特别是不明原因的不孕症患者，采用微刺激可以获得更高的妊娠率。一般采用来曲唑-HMG重叠方案做轻微刺激当主导卵泡平均经线到达18-22mm，内膜超过8mm，雌激素超过150pg/ml,如果无自发LH峰，注射曲普瑞林诱发排卵。35-37小时AIH。AIH一般不需要做黄体支持，一次AIH即可。LLetrozole2.5mgCycledayAIH三、来曲唑微刺激排卵障碍的患者，采用来曲唑—HMG序贯方案，参考冷冻胚胎移植内膜准备-来曲唑微刺激章节。四、验孕和孕期监测AIH通常在术后第17天验孕，孕期注意事项和监测参见第一篇第五章第三节(Page71)。

第二篇辅助生殖实验室技术操作规范第一章.精液检查及精子制备第一节、精液常规检查操作方法实验者收到取精杯后应首先核对取精杯上姓名、编号是否与精液送检单符合，同时核对精液送检单上是否漏填重要信息，确认无误后方可接收。操作技术将在原按WHO第四版实验指导手册的基础上过渡，逐步以WHO第五版实验指导手册(WHOlaboratorymanualfortheExaminationandProcessingofhumansemen，fifthedition)所规定的方法实施精液常规检查，并以其规定格式出检验报告。同一份精液标本若有多个检查项目，按各项目要求分别做标本处理和检验。(一)初步检验：1．液化后精液检查前应认真记录：精液检查通知单所提供的全部信息2．观察记录：精液量、颜色、粘稠度、Ph值及液化时间3．取液化精液10微升滴于洁净载玻片上，用盖玻片覆盖后静止片刻4．置生物显微镜下观察精液大致状况并记录镜下所见：圆细胞数(生殖道上皮细胞、生精细胞及白细胞)、红细胞数和凝集团块等，并以个/HP表示。(二)操作方法：1．取液化后精液10微升，滴于MACRO计数板中央计数池内，加盖；2．置生物显微镜下观察精子浓度及活力。具体方法如下：分别计数10个小格内前向精子(PR)、非前向精子(NP)及不动精子(IM)的数目，PR+NP+IM之和即为精子密度(×106/ml)，精子活力分别以PR精子、PR+NP精子占总精子数的百分比表示，计算方法为：PR/(PR+NP+IM)×100%，(PR+NP)/(PR+NP+IM)×100%。附精子活力分级标准：PR：前向运动精子，不考虑速度NP：各种形式的非前向运动精子IM：不动精子(三)检验后处理1．以清水冲洗MACRO计数板并用酒精棉签擦拭；2．以酒精纱布擦拭显微镜台面及实验台面；3．一次性实验物品丢弃于指定地点；4．剩余标本按规定进行污物处理第二节、精子形态分析操作方法1．取液化后精液20微升，滴于载玻片一端(上方约1/3处)；2．用另一张载玻片置于滴有精液处与其形成30度角，均匀拉开液滴(详见WHO实验手册)，室温干燥；3．将干燥后的载玻片置于95%酒精中固定15分钟，取出室温干燥后行巴氏染色；4．100倍油镜下行精子形态学分析，计数100~200条精子。结果描述：参阅WHO实验手册正常形态率%异常形态率%(分别记录：头、体、尾及混合畸形率)第三节、精子低渗肿胀试验(HOS)(一)配制低渗肿胀液溶0.735g枸椽酸钠Na3C6H5O7·2H2O和1.351g果糖于100ml蒸馏水中。将该溶液分装于-20度冻存。用前解冻并充分混匀。(二)实验方法1．取1ml肿胀液于一只加盖的Eppendorf管中，37度温热约5分钟。加入0.1mL液化精液，并用吸管轻轻吹打混匀。2．在37度下至少保持30分钟(注意：不要超过120分钟)，相差显微镜下观察精子细胞。3．计数200条精子，计算发生肿胀的精子所占百分比。精子尾部形状发生变化的定义为精子肿胀。(三)结果描述肿胀精子所占百分比可以代表存活精子的比例。(四)注意事项1．某些精液标本在置于HOS溶液前即有尾部卷曲的精子，因此要在放置于HOS溶液前观察射出精液。处理后获得的尾部卷曲精子的百分比减去未处理标本中尾部卷曲精子的百分比，即可以得到HOS试验中出现反应的精子的实际百分比。2．在临床使用前，应当用老批号的HOS溶液对新批号的HOS溶液进行校验，二者不应有显著性差异(配对t检验P＞0.05)。如果差异显著应废弃该批试剂，重新配制。全自动精子分析系统使用说明(西班牙SCA全自动精液质量分析系统)全自动精子分析系统可自动探测精子运动轨迹，按WHO实验手册内CASA各项参数指标，计数精子活率、活力、密度、直线运动速率等。系统由电脑软件和显微镜两部分组成。操作方法如下：(一)初步检验：参见精液常规检查操作方法相关部分。(二)自动分析：1．开启电脑→CASA分析软件→建立新档案(键入患者信息)→保存2．取液化精液10微升滴于精子计数板中央计数池内，加盖玻片→置相差显微镜下(10×)调节视野至图像清晰3．点击密度活动力分析→进入分析界面→分析→保存结果(如果需要，可以做人工校正)→报告单(预览或打印)→退出分析系统4．报告部分内容记录于《精液分析登记本》上，年终存档保留。(三)分析后处理：参见精液常规检查操作方法相关部分。第五节、抗精子抗体(MAR)检测方法(一)原理：本试验以人IgG敏化绵羊红细胞，用人IgG制备羊抗人IgG血清，采用MAR法检测标本中IgG类抗精子抗体。试剂由A液、B液和C液组成。(二)步骤：1．取液化精液10微升滴于载玻片上，加入A液10微升混匀，放置15秒；2．加入B液10微升混匀，覆以盖玻片。分别在3分钟和10分钟后于生物显微镜(40×)或相差镜下镜检，观察运动精子表面是否黏附有敏化的红细胞(sRBC)。(三)结果判定：1．精子表面无AsAb，可见精子在粘附的sRBC间自由泳动，敏化sRBC间的凝集说明试剂可靠。2．精子表面有AsAb存在，则敏化sRBC粘附于精子上并一同扭动。在强阳性情况下，凝集块极为巨大，精子只在敏化sRBC形成的凝块中扭动。3．至少计数100条活动精子，计算粘附有sRBC的活动精子在总活动精子中所占的百分比。4．阳性率R=(粘附sRBC的活动精子数/计数总活动精子数)×100%R≤10%，判定为阴性；R＞10%，阳性；R≥40%，判定为强阳性。(四)注意事项：1．试剂需室温平衡后使用；2．A液使用前应充分混匀；3．液化不良精液可用C液洗涤后检测；4．标本中活动精子密度高时，应适当增加活动精子计数的数目。第六节、细针附睾/睾丸穿刺取精术及精子制备常规(一)操作步骤：1．准备10ml和5ml及1ml注射器各1支，2%利多卡因5-10ml。将5ml2%利多卡因注射在阴囊部精索内，封闭精索神经。2．术者用左手固定附睾，选择无血管区以1ml注射器在睾丸表面及阴囊皮肤内注入0.5ml2%利多卡因作局部麻醉后，以10ml注射器直接经皮刺入附睾或睾丸后，边持续负压抽吸边退出，利用负压抽出附睾内精子或睾丸内曲细精管，取下放入含培养液的培养皿中间凹内，立即转交实验室处理。3．压迫穿刺点至无出血，垫一块纱布于内裤里，患者即可下床行走，嘱其2小时不做剧烈运动。(二)实验室处理：1．将培养皿内的曲细精管用两支1ml注射针挑动，翻转洗涤1~2次；2．将曲细精管叠加切割(撕碎)，使精子及其组织细胞游离于培养液中；3．用于临床诊断可立即镜检(20×)观察有无精子，活动否，通知临床医生；4．用于临床治疗(ICSI)，混悬液吸入离心管中，静置培养箱孵育30-60分钟，直到用前反复吹打混匀，再静置数分钟，待大块组织沉淀后将上层液体离心(1500转,10分钟)后使用。第七节、伊红试验(一)准备试剂用9g/L氯化钠水溶液配制5g/L的伊红Y溶液。(二)试验方法1．将一滴新鲜精液与一滴伊红溶液在载玻片上混匀，并覆以盖玻片。30秒后在400倍光学显微镜下观察。2．计数200条精子，并区分活精子与死精子。活精子不着色(白色)，死精子被染成红色。(三)结果描述计数条活精子数条(%)死精子数条(%)第二章.宫腔内人工授精的实验室处理第一节、取精取精前一般禁欲5-7天，过长或过短的禁欲时间均有碍精子的质量，但对于精液差的病例可适当延长禁欲时间。取精时间安排在IUI前1-2个小时，取精在专用取精室中进行，室内配有双人床或三人沙发，每日紫外线消毒、擦台面。病人在取精过程中须保持取精室周围环境安静，以免造成精神紧张引起取精困难。若发生取精困难可以性交方式取精；有些男性不习惯医院环境可在家取精并在半小时之内将精液送至医院，运送过程中应注意精液保温。取精前患者丈夫先排尿冲洗下尿道，清洗双手，将已写上姓名及病史号的取精杯交患者丈夫并做如下交待：取精杯已消毒，勿污染杯内壁，精液射入取精杯后应立即将杯盖旋紧尽快送实验室处理。实验室收到取精杯后应记录收到时间、核对姓名。逆行射精的取精方法：逆行射精主要表现为患者性交过程中有射精感，但没有精液射出。若膀胱颈在将要射精时未能关闭，射出的精子可能会逆行进入膀胱中，性交后在尿液中发现精子则可确诊。对于逆行射精患者需要特殊处理，取精前口服碳酸氢钠4克5-7天以碱化尿液，有利于保持尿液中精子的活动力。不可服用咖啡及饮料，可以服茶水，服水的目的是使尿液的渗透压降低，若有条件测量尿液的渗透压，在尿液渗透压达到280-320之间时取精最好，取精前测量尿液的PH值，应在6.8-7.4之间。逆行射精的患者需要特殊的容器来收集精液，手淫前排尿，不必完全排空膀胱，如果手淫中有精液射出应收集于容器中，手淫后立即排尿或导尿将尿液收集在另一个容器中。尿液样本必须马上处理，因为即使在服用了重碳酸盐之后尿液仍是酸性的，几乎会立即杀死精子。一旦样本送到实验室，马上测量及记录尿液的体积及PH值。尿液样本必须要充分混匀，因为死精子会下沉到容器的底部。所有的精子，即使是不动的精子，都需要计数。将一滴尿液样本滴在载玻片上进行计数，如果精液数量足够多，还应滴一滴精液样本在Maker板上进行分析。对浓缩后的尿液及可能获得的精液，采用密度梯度离心处理，尿液样本以1500g离心10min。然后用新鲜的培养液重新悬浮沉淀。离心时，正常射出的精液(如果有的话)也应进行分析。从尿液中取得的沉淀也应该在载玻片上或者Maker板上分析其密度、活力以及形态。第二节、精液处理1.试剂：1)精子洗涤培养基：用于精液洗涤和培养的试剂很多，但有二点是共同的，第一，均含有人体蛋白，如白蛋白或血清；第二，均含有葡萄糖。这两个成分是精子体外获能所必需的。用于精液洗涤的培养基按其所含的缓冲剂不同分为两大类，一类是以碳酸氢钠做为缓冲剂，需在5%的二氧化碳气体中保持pH值在7.4左右，但在空气中很快变碱；另一类培养基含有低浓度碳酸氢钠及高浓度的HEPES，这类试剂在空气中pH变化很缓慢，可长时间保持pH在7.4左右，但在5%二氧化碳环境中pH值变酸。以上两类培养基均可用于精子洗涤，但有研究表明用含HEPES的培养基处理精子能更好地保护精子的功能，IUI妊娠率更高。目前精子洗涤培养基已商品化，有些出厂时已添加人体白蛋白(HSA)，有些需自己添加蛋白或血清。培养基可以是简单的平衡盐溶液如人输卵管液(HTF)、Earle‘s液(EBSS)、Tyrode’s液(T6)等，有些精子培养基配方很复杂，如Ham‘sF10。2)梯度离心试剂：目前用于梯度离心试剂很多，本中心使用的Isolate在出厂时渗透压、pH值及梯度已调好并做过严格的生殖毒性检测，用前只需预温，现开现用。2.仪器及耗材1)仪器：离心机(水平式)、干热培养箱、恒温试管架、电动加样器、超净工作台、冰箱、试管架、显微镜、精子计数板。2)耗材：15ml尖底离心管、14ml圆底离心管、10ml刻度量管、9英寸无菌巴士德管、人工授精管(Tomcat)、1mlB-D注射器、5ml全塑料B-D注射器、酒精灯、硅胶接头、载玻片、盖玻片。3)精液冷冻保存设备及试剂、耗材：液氮、液氮罐、精液冷冻试剂、冷冻管等。3.处理前准备1)取精前临床工作人员应通知实验室有关人员预温处理精液所需的试剂及试管，打开超净工作台并准备仪器。2)精液取出后应尽快放35-37C恒温培养箱中保温，每5-10分钟摇动几下促使精液液化。3)正常精液在30分钟内液化，若超过30分钟仍不液化应使用带针头的全塑料注射器反复抽吸精液直至精液液化。4)若精液中琼脂样颗粒多应将精液倒入试管中垂直静置一定时间待琼脂样颗粒沉入管底后吸取上层液体处理。5)精浆中含有受精抑制成分，应尽早将精子从精浆中分离，精液一旦液化应尽快处理，处理前取少许精液做常规检查测量精子浓度、成活率及运动率，并根据检查结果选择处理方式。6)实验室工作人员在收到精液杯后应仔细核对杯上的姓名和病史号，凡接触精液的各种试管、巴士德管均需清楚标记，接触过病人体液的试剂不得再用于其他病人。精液中可能含有致病微生物，处理时工作人员应戴一次性手套、口罩、帽子，处理精液后用75%的酒精或10%双氧水擦洗台面，超净工台应定期消毒和细菌培养。4.精液处理方法1)调恒温箱：温度设定为35度2)试剂:Isolate、SSS、HTF-Hepes3)处理步骤：精液取出后置恒温箱液化,同时将试剂及试管放恒温台预热待精液液化后取少量精液计数，如果前向运动精子总量少于二百万不可用梯度离心，应使用离心洗涤法。取一支15毫升尖底离心管，先加1毫升IsolateUP，后加1毫升IsolateDOWN,再加精液，200g离心20分钟去上清,沉淀+1ml5%sssHTF-Hepes(不能碰壁)混匀200g离心5分钟(或100g离心10分钟)重复洗涤两次去上清,沉淀加0.3-0.5ml5%SSSHTF-Hepes混匀取少量精子悬液计数B．上游法适应症基本同上，但是精液粘度高或不液化则不适宜用上游法，一般上游法的回收效率比非连续梯度离心要低。1)方法一：精子经两次洗涤后，弃上清，沉淀留管底，小心沿管壁加入5%SSSHTF-HEPES1ml倾斜45度置37度恒温箱45分钟，2)方法二：将精液标本置试管底部，小心沿管壁加入含5%SSSHTF-HEPES1.5ml倾斜45度置37度培养箱孵育45分钟，收集云雾状上层培养液，经两次洗涤后沉淀用0.5ml洗精液悬浮做授精用。C．两次洗涤法适用于前向运动精子总数低于200万的病人，冷冻精液人工授精一般也用两次洗涤法。一份精液加一份洗精液稀释，200g离心5分钟，沉淀加1ml洗精液悬浮，离心洗涤两次后沉淀加0.3-0.4ml洗精液悬浮做授精用。第三节、授精人工授精前阴道超声扫描看有无排卵。人工授精不需阴道消毒，但用无菌生理盐水纱布擦洗阴道和颈管。将TOMCAT管预先做适当的弯曲，接上1mlB.D.注射器,并将注射器活塞推到底,核对精子无误后将精子悬液吸入到授精管和注射器中。将授精管宫颈管轻轻插入到宫腔中，缓缓将精子悬液注入宫腔，轻轻退出授精管和窥阴器。授精后患者平卧一刻钟。离院前向病人交代若有恶心、呕吐、腹痛、严重腹胀、体重明显增加等卵巢过度刺激症状应立即复诊。第四节、文件书写IUI前签定“夫精宫腔内人工授精知情同意书”。按“不孕症检查常规”书写病历及作辅助检查，促排卵或超排卵过程记录在“治疗单二”中，精液处理和授精过程记录在“宫腔内人工授精记录单”中。若妊娠将妊娠过程记录在“妊娠结局记录单”中。第三章.体外受精-胚胎移植常规第一节、仪器准备(最迟提前2天)胚胎实验室风机、空调24小时不间断运行，室温控制在24度(±2度左右)。取卵手术室、ET室使用结束后关闭风机和空调，用前半小时打开。CO2培养箱:每日开箱前观测箱温(水银精密温度计)每周一次使用CO2测定仪监测培养箱的CO2浓度，记录并同时记录箱温每周换水擦洗一次，并作记录胚胎操作箱:每日观测箱温，并作记录每周一次使用CO2测定仪监测操作箱的CO2浓度，记录并同时记录箱温对异常变动要先报告实验室负责人，再由负责人根据观测情况进行调动，并在24小时内观测其是否恢复正常每日加水，每周一下班前清洁一次。第二节、试剂1.HTF和U-IVF:分装于大、小试管，(HTF分装10ml/大试管用于拣卵预培，U-IVF分装1ml/小试管用于处理后精子培养用预培)，提前一天置于CO2培养箱平衡。用途:大试管液体用于洗卵,配授精盘(一般井皿每孔装卵不超过8个,根据卵的多少配1-2个盘)；小试管液体用于精子培养。2.ECM+10%SSS:9mlECM+1mlSSS，提前一天置于CO2培养箱平衡用途:用于制备分裂期胚胎培养皿。3.MB+10%SSS:9mlMB+1mlSSS，提前一天置于CO2培养箱平衡用途：制备囊胚期胚胎培养皿。4.如果用CSC培养基，则不需2.和3.培养基：CSC+10%SSS:9mlMB+1mlSSS，提前一天置于CO2培养箱平衡。用途：制备从受精卵至囊胚期的胚胎培养皿。5．冲针液:flushingmedium至少提前1天37℃预温用途:用于冲洗卵泡。6．Isolate:用途:处理精液，用前配制，先批量分装1mlLow液于多个尖底离心管，再在各Low面上轻轻加上Up液1ml备用。7．HTF-HEPES+10%SSS：9mlHTF-HEPES+1mlSSS，分装于2个试管中(5ml/试管)，密闭，放4度冰箱备用。用途：用于精子洗涤，ICSI皿配盘。用量：每个病人5ml。第三节、所需物品巴斯德管,直径为100mm的大平皿,35mm的小平皿，井皿,大试管,小试管,1ml注射器,吸头,各种接头,刻度离心管,毛细巴斯德管,试管架,煤气喷灯,镊子,电动加样器,纱布,取精杯，精液点样滤纸等第四节、步骤1.提前一天：配制洗卵授精液、胚胎培养液、精子洗涤液等试剂,并将洗卵授精液、胚胎培养液置CO2培养箱中平衡过夜，精子洗涤液密闭置4度冰箱保存，冲针液置37℃预温。授精盘配置方法：在超净台下按无菌操作要求将授精液(HTF)2ml加入井皿外围，将HTF1.0ml加入井皿中央，外围用于洗卵，中央用于授精。注意：受精盘的底座与盖均应用记号笔注明病人姓名及ART号。2.Day0:取卵当天:(即注射HCG后36h)(1).开通二氧化碳气体，待气体浓度显示稳定后可测定培养箱中二氧化碳浓度，并检查胚胎操作箱温度，作相应校正。(2).根据当天取卵例数，预温相应井皿、大平皿，并准备相应量纱布、1ml注射器。(3).取卵前准备一支巴斯德管,，从培养箱取出洗卵液,将洗卵液放置于已预温的井皿中配制洗卵盘，井皿外围加液2ml，中央加液1ml。找卵过程中将找出的卵放于井皿外围进行清洗，应注意将血细胞清洗干净，必要时用1ml注射器切除污染的血块、血斑及黄素化的颗粒细胞，捡卵结束时将已清洗干净的卵冠丘复合体成批放于井皿中央培养。(4).取卵结束后丈夫取精，精液(精液杯已标明病人姓名)置35℃恒温箱液化，液化后尽快处理精液。若精液取出半小时后仍不液化，使用2ml全塑料注射器反复抽吸精液促使液化。取精前开始预温Isolate、精子洗涤液、2支15ml尖底离心管(室温)。精液处理方法：准备两支巴斯德管(标明病人姓名),涂片镜检精液情况,根据精子的密度和活力适用不同每层厚度的梯度离心方法(如0.3ml,0.5ml,1ml，一般用1ml)。取一支如前批量准备的Isolate液管,标注病人信息，加入2ml精液(.加入精液量依精子浓度、活力而定，一般为2ml。若精液差，可采用多管离心，每管加精液1-2ml)。200g离心15分钟后仔细去上清,留沉淀,换管将沉淀移入到干净预温的梯度离心管中，加1mlHTF-HEPES洗涤精液，轻轻摇匀,200g离心5分钟,或者100g离心10分钟,洗涤2次后去上清,加入适量精子培养液(分装于小试管的1mlU-IVF)，取少许精子悬混液计数精子浓度，根据计数结果将精子浓度调整到300万/ml-1000万/ml，将处理好的精子置CO2培养箱中培养至少半小时方可授精。(5).取卵后4-6小时,将授精盘取出,每个井皿中央加精子30万条，混匀，立体显微镜下再次观察精子密度待确定密度合适时置培养箱内培养过夜。授精时间应根据卵的成熟度决定，若卵很成熟应在取卵后4小时授精；若卵中度成熟在取卵后5小时授精；若卵成熟度差应延迟到8小时后授精。(6).配制生长液滴皿,(皿的底座与盖均应标明病人姓名，皿盖要标ART号)CO2培养箱平衡过夜3.Day1:(1).去除颗粒细胞,即拆蛋,将受精卵移入已预温平衡的CSC胚胎培养皿中,1个/液滴,培养箱中继续培养(2).于倒置显微镜下观察受精情况4.Day2Day3:胚胎观察并冷冻/移植(1).观察胚胎，并做好记录。(2).挑选优质胚胎冷冻或者移植,非优质胚胎囊胚培养(3).装胚胎(详见胚胎移植常规):将注射器与移植管旋紧,即可装胚胎,顺序为:10mm液体→3-5mm空气→胚胎+液体10mm→3-5mm空气→2mm液体5.囊胚培养：(如果是连续培养基CSC培养，则可省略该两次配盘及转盘操作)(1)．Day2下午及Day4下午配置MB囊胚培养液滴皿，(皿的底座与盖均应标明病人姓名)CO2培养箱平衡过夜。(2)．Day3下午将需要囊胚培养的胚胎移至囊胚培养液中，观察并做好记录。(3)．Day5上午观察胚胎并做好记录。(4)．Day5下午冷冻优质囊胚，未成囊胚胎转移至新的囊胚培养液中培养。第四章.卵细胞浆内单精子注射常规卵细胞浆内单精子注射技术(IntrocytoplasmicSpermInjection，ICSI)是治疗严重男性因素不孕患者的最有效治疗方法，在辅助生殖技术中占有重要地位。ICSI的操作方法在各实验室虽有细微差异，但目前尚无足够的资料证明各实验室实验过程及操作方法上的区别会对妊娠结果有影响。本文将重点介绍本中心进行ICSI的实验程序。第一节、仪器配置及注射前准备(一)仪器配置1．进行ICSI操作时应使用高分辨率的倒置显微镜，目前有多种品牌的高档倒置显微镜能满足ICSI的操作要求，但选购时应考虑以下几个方面：1)必须配置Hofman或微分干涉(DIC或Nomarski)光学系统。目前国内外大多数实验室使用的是Hofman光学系统，虽然微分干涉光学系统的分辨率比Hofman分辨率高，但微分干涉系统必须使用玻璃培养皿且价格昂贵，因而较少使用。2)配4倍，10倍，20倍物镜，方便操作。3)使用万能载物台4)安装恒温加热装置，如恒温加热板或恒温加热箱2．显微操作仪显微操作仪的作用是将大幅度的动作转换为微细的动作，其质量的好坏会直接影响操作的方便性。目前国内外使用最多的是日本Narishige公司生产的液压显微操作仪，这种显微操作仪由粗动定位及精细操作两部分仪器构成，前者为机械式或电动控制，其工作距离大，但不精密。后者为液压控制，其工作距离小，精密度在一定范围内可调，能进行X、Y、Z三个方向运动，并有万向摇柄能在水平面任意方向运动，万向摇柄有直立式及悬吊式两种可根据个人习惯选择。显微操作仪应与所配的倒置显微镜匹配，如果显微镜使用恒温加热箱，恒温箱必须与显微操作仪匹配。3．显微注射仪进行卵细胞浆内单精子注射时用显微注射仪控制注射针 (microinjectionneedle)及持卵针(holdingpipette)内的液体运动，因此显微注射仪的好坏决定ICSI的成败。国内外大多数单位使用微米注射仪进行显微注射。4．摄录像装置配备450线以上的摄像头和监视器，配备高清晰度像机。5．防震平台高频震动会使显像模糊，增加注射难度，如果所在实验室有震源干扰，应使用气垫台进行防震。本中心进行卵细胞浆内单精子注射的仪器配置如下：OlympusIX71倒置显微镜配4倍明视野物镜，20倍及40倍Hofman物镜NikonTE300倒置显微镜配4倍明视野物镜，10倍及20倍Hofman物镜OlympusIX-IBM恒温箱及恒温加热控制仪NarishigeMMN-1机械式显微控制仪两个进行粗动定位NarishigeMMO-202N油压操作仪两个进行微细操作UT-2关节两个HT-7持针管两个HamiltonGastight螺旋注射器一支控制持卵针内的液体运动JVCTK-C1381摄像头JVCBM-H1400PN监视器(二)显微注射针进行ICSI时使用两种显微注射针：即持卵针及显微注射针。显微注射针由外径1毫米、内径0.78毫米的硼硅玻璃毛细管拉制而成，管尖内径5微米，外径7微米。管末端平面与毛细管纵轴呈30-45度的夹角，并拉成小刺(spike)，管末端约1毫米长的毛细管与管体折成一定夹角，一般为35度。持卵针也由外径1毫米，内径0.78毫米的硼硅玻璃毛细管拉成，管尖外径70-120微米,管尖开口15-30微米，管末端平面与毛细管纵轴垂直，管末端约1毫米长的毛细管与管体折成一定夹角，一般为35度。目前商品化的显微注射针有多种品牌，相互之间有一定的细微差别，本中心使用的是HUMAGEN生产的35度夹角的显微注射针。(三)仪器安装及调试新购买的倒置显微镜及显微操作系统在安装完毕后需进行反复的调试，包括Hoffman系统的调节、恒温装置的调节及显微操作仪的调节。对显微操作仪进行调节的目的是使其X、Y、Z各向运动达到最大，持针管和显微镜载物台的夹角应和所选购的显微注射针的夹角一致，以使安装后的显微注射针的前端毛细管基本与水平面平行。第二节、卵细胞浆内精子注射的适应症ICSI是治疗严重少、弱精症的有效手段，凡经IVF治疗受精率低于50%的病例均是ICSI的适应症。近年来由于ICSI技术的改进及对ICSI操作本身安全性的肯定使ICSI的适应症已逐渐扩大。对于无前次IVF受精率的资料作参考的病例在考虑是否进行ICSI前应行精子回收实验，若回收实验达到IVF的标准则不考虑ICSI，若回收实验仍不能决定是否进行IVF或ICSI，则一部分卵子行IVF，一部分卵子行ICSI。1．精液中正常形态精子超过10%且回收活动精子超过50万条可进行常规IVF，若受精率低于50%在下一个周期做ICSI。2．精液中正常形态精子不超过10%但回收活动精子超过50万条则部分卵作IVF部分卵作ICSI，如果IVF受精率超过50%在下一个周期作IVF。3．回收活动精子低于50万条或精液中偶见精子行ICSI。4．睾丸或附睾取精病例作ICSI。5．免疫珠实验超过50%的精子头结合IgA抗体则行IVF加ICSI。6．前次IVF受精率低于50%行ICSI。7．不明原因不孕症经超排卵加宫腔内人工授精三个周期未妊娠者行IVF加ICSI。8．卵子质量差或胚胎质量差均不是ICSI的适应症。第三节、ICSI操作程序(一)取卵前日：1．配PVP：1支PVP干粉(Irvinescientific)加1mlHepes缓冲的人输卵管液(HTF-Hepes，IrvineScientific或InVitrocare)注意不要加蛋白，加液后静置两小时以上，待完全溶解后转入小试管中放置于4度冰箱，可使用一个月，使用前37度预温后即可使用。本中心使用即用型10%PVP溶液(IrvineScientific)。2．配透明质酸酶：1瓶透明质酸酶(Sigma，H-4272每瓶约30mg)加入30mlU-IVF(UniversalIVFMedium，Origio)配成每毫升800单位浓度，按每管1ml分装，-20度冷冻可长期保存。解冻后放4度冰箱可使用一月，使用前放二氧化碳培养箱平衡过夜，拆蛋时每1ml拆蛋液加1-2滴800IU/ml透明质酸酶即为浓度为20-40IU/ml的工作液。如果拆蛋过程无二氧化碳控制则应使用HTF-Hepes配制透明质酸酶，配制浓度及保存方法同上，但使用前不可放二氧化碳培养箱平衡，临用前放37度恒温箱平衡即可使用，使用方法同上，但使用的拆蛋液为含Hepes的HTF。本中心除显微注射过程外其他胚胎操作过程均在二氧化碳控制下进行，以下描述为本中心进行ICSI操作的具体过程。3．拆蛋液：U-IVF加10%SSS(SerumSubstitutiveSupplement，IrvineScientific)5ml放二氧化碳培养箱平衡过夜。4．注射液：HTF-Hepes加10%SSS5ml分装在两个小试管中，分别为3ml、2ml分别作洗精及注射用，用前温度平衡。5．矿物油：4ml矿物油用前温度平衡6．其他试剂：取卵液、冲针液等同体外受精7．生长液：ECM或CSC液加10%SSS做生长液，用前配成微滴置二氧化碳培养箱平衡过夜，显微注射结束后将注射卵转入其中培养。8．若行睾丸穿刺或活检取精则需准备HTF-Hepes+10%SSS10ml及U-IVF或HTF+10%SSS2ml(用前平衡6小时以上)(二)取卵当日1.取卵同体外受精。2.精液处理：由于少、弱精症患者精子体外存活时间短一般精液处理时间选择在显微注射前,精液处理完毕后应尽快做显微注射以免注射前精子死亡，对于严重少弱精的病例应特别注意。1)常规ICSI精液处理：两次离心洗涤。操作步骤如下：精液充分液化后加入1-2mlHTF-Hepes+10%SSS吹打均匀，1500转离心3-5分钟，去上清后沉淀加入HTF-Hepes重悬，再次离心洗涤，最后用0.3-0.5mlU-IVF或HTF+10%SSS重悬沉淀(根据沉淀多少决定加入的液体量)，取少许精子悬混液显微镜下观察精子浓度，培养箱中放置备用。2)附睾精子处理：两次离心洗涤，步骤同上。3)睾丸穿刺或活检组织处理：一般在取卵日上午进行经皮细针睾丸穿刺抽取睾丸组织，睾丸组织在HTF-Hepes+10%SSS中漂洗去除血细胞后移入1-2ml干净的HTF-Hepes中，用一次性1ml注射器针头切碎，悬浊液置倒置显微镜下观察证实有活动精子后，将悬浊液离心洗涤两次，0.1-0.3mlU-IVF或HTF+10%SSS重悬沉淀(根据精子数量多少决定加入的液体量)，置于二氧化碳培养箱备用。提前进行睾丸穿刺的优点是，睾丸组织中未成熟精子经过培养，可提高精子的活动力及活动率使显微注射过程更加顺利。经细针睾丸穿刺未找到精子的病例仍可进行睾丸切开活检，有时能获得足量的活动精子。3．拆蛋：拆蛋的目的是用透明质酸酶消化卵冠丘复合体外层的卵丘，然后用机械的方法除掉卵母细胞外的放射冠使卵母细胞暴露。拆蛋的时间为取卵后3-4小时。拆蛋程序：1)准备工作：预温一块中心皿，一支巴士德管，两支毛细玻璃管(一支内径比卵稍细，另一支内径比卵稍粗)。2)配拆蛋盘：操作箱通二氧化碳后取出在二氧化碳培养箱中已平衡的拆蛋液(U-IVF或HTF+10%SSS)及透明质酸酶储备液，分别在中心皿中心和外围处加拆蛋液1ml，用巴士德管加3滴透明质酸酶储备液于中心孔中，吹打均匀。3)消化卵丘：将卵冠丘复合体放入中心孔中(每次3-5个)用巴士德管反复吹吸约10秒，然后尽快将外周包有放射冠的卵细胞转入中心皿外围的无透明质酸酶的拆蛋液中，等待除去放射冠。因为透明质酸酶的长时间作用对卵子可能有潜在的损害，所以卵子与透明质酸酶接触的时间应尽可能的短，洗涤时从上一个孔带入下一孔的液体应尽可能的少。重复此步骤直至所有的卵冠丘复合体的卵丘被消化。4)除去放射冠：用已拉好的内径稍细的毛细玻璃管吹吸卵放射冠复合体，使放射冠脱离卵母细胞，待所有的卵母细胞放射冠均除去后，用内径稍粗的毛细玻璃管将卵子ECM洗涤液中洗涤3-5次，最后转入ECM培养液滴中，放回二氧化碳培养箱中待用。4．安装显微针：将石蜡油注入两侧显微注射仪的管道中排尽其中的气泡。在4倍物镜下安装持卵针，调节UT-2关节并旋转持针管使持卵针末端部分处于水平位并与X轴平行。按同样的方法安装注射针。两侧显微针安装完毕后将两针升起，两针高度应超过注射盘的高度。5．准备显微注射盘：1)在拆蛋前预温一个Falcon35mm的培养皿，预温PVP、注射液及石蜡油。2)由于注射盘液滴很小，为减少液体挥发，作注射盘时动作应迅速，事先应准备好所需的各种物品及试剂，液滴作好后应迅速加石蜡油完全覆盖。3)本中心用35mm培养皿盖作注射盘，液滴形状、大小及分布如下图，液滴分布应在直径25mm的区域：说明：1-11号液滴为注射液，直径2-3mm，每滴放卵1-2个12号液滴为PVP13号液滴为注射液，放置精子14号液滴为注射液，用于洗卵，面积约5*10mm2由于注射盘深度约5mm，因此各液滴厚度应低于2mm注射盘作好后，将卵转移到14号液滴中，清洗后将成熟的卵母细胞转移到1-11号液滴中，每滴1-2个卵。自12号液滴右下角将精子悬液缓缓加入其中，加入量视精子浓度而定，但沉淀扩散的范围不超过液滴转折处。6．准备注射系统1)将作好的注射盘置于倒置显微镜载物台上，下调注射针及持卵针直至接近石蜡油的表面。2)移动视野至14号液滴，将石蜡油注入持卵针中至管尖，然后将持卵针下降到14号液滴中，吸入约5毫米液体，再将注射针升高到石蜡油表面以上。3)移动视野到PVP液滴，将石蜡油注入到注射针中至管尖,注射针下降到PVP液滴中，吸入少许PVP到注射针内，待针内压力平衡后即可开始显微注射。7．卵细胞浆内精子注射1)移动注射针至13号液滴左侧边缘，将形态正常的活动精子吸入到注射针内，移动注射针至PVP液滴将精子排入其中。2)用注射针针尖压住精子尾部，将注射针迅速划过精子尾部使精子制动。精子制动的目的是破坏精子尾部的细胞膜而使其激活卵子，有利于受精。3)将注射针针尖对准已制动精子的尾端缓缓将精子吸入到注射针内。每次可吸入1-2条精子，注射1-2枚卵子，2条精子之间的距离一般超过三个精子的长度。4)将注射针移到1-11号液滴中，下降持卵针将待注射的MⅡ期卵母细胞轻轻吸住，用注射针转动卵母细胞将极体放在6点或12点处，然后将卵母细胞吸紧。调节显微镜焦点对卵母细胞赤道部聚焦，调节注射针位置使注射针与卵母细胞赤道部在同一个平面，将注射针轻轻按压于卵母细胞上证实卵母细胞与注射针在同一个平面后将最前端的一个精子轻轻推至针口然后将注射针刺入卵母细胞内，刺入深度约为卵母细胞直径的三分之二，在精子排出前先回吸胞浆直至胞浆在针管内快速流动时立即将精子连同吸出的胞浆注入到卵母细胞内，一旦精子头部进入胞浆即可将注射针轻轻退出到卵母细胞外。回吸胞浆的目的是为了破坏细胞膜保证精子注入到细胞浆内。注入精子时流入胞浆内的PVP量应尽可能的少。5)将固定在持卵针上的卵母细胞轻轻松开再固定另一个待注射的卵母细胞重复以上步骤直至所有的MII期卵子均被注射。6)注射完毕后将已注射的卵母细胞转移到生长液滴清洗3次后按每滴1枚卵子进行培养。7)注射后12-20小时检查是否受精，一般受精后48小时进行全胚胎冷冻或新鲜胚胎移植。第五章.卵子辅助激活常规一、卵子辅助激活指征既往ICSI不受精或者受精率低的患者。二、激活试剂配制购置西格玛的ionomy