柴胡种子DNA分子鉴定规程

1柴胡种子DNA分子鉴定规程本文件规定了柴胡种子DNA分子鉴定的实时荧光PCR技术原理方法和操作规程。本文件适用鉴定中药材南、北柴胡种子的真实性。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光PCRReal-timePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.2Ct值Cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理基于实时荧光PCR技术，建立多重实时荧光PCR检测体系，采用DNA条形码中的ITS基因序列为靶基因，设计柴胡的通用引物与探针以及南柴胡和北柴胡的特异性引物和探针，通过对荧光聚合酶链式反应反应体系和反应条件的优化筛选，建立了多重实时荧光聚合酶链式反应方法，在同一聚合酶链式反应反应体系中可以同时鉴别南、北柴胡种子的源性成分。5仪器设备及试剂25.1仪器设备仪器设备见附录表A.1。5.2试剂5.2.1试剂见附录B.1。5.2.2试剂的配制方法见附录B.2。5.2.3除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。6检测引物和探针引物序列和探针，见表1表1引物和探针序列JOE-CCTCCGCAGCTCGCTCGAAGFAM-AAGAGAGTCACCGGAGATCGGAAAACROX-CGTAGCGAAATGCGATACTTGGT7DNA提取每份材料混合取0.3g（大约200粒），用灭菌后的研钵在液氮状态下研磨成粉末。将含有2%β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液置于65℃水浴锅中预热；将研磨好的样品取0.15g置于2.0mL的离心管中；加入700µL65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃保温30min，期间摇动3-4次；加入700µL氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒使其充分混匀，12000r/min离心10min，吸取上清液转移至另一个离心管中；将上清液转移到新的离心管中，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，将其充分混匀，置于-20℃30弃掉上清液，此步骤重复一遍；室温下或超净工作台中自然风干DNA（不可太干）5-10min；加入50µL3的双蒸水或TE缓冲液，涡旋振荡充分混匀，12000r/min离心2min，4℃保存备用或置于-20℃保存。也可用相关植物提取试剂盒进行柴胡种子DNA的提取。8核酸浓度及纯度测定用Nanodrop紫外分光光度计对提取的DNA进行核酸浓度与纯度检测，OD260nm和OD280nm处测定其吸光值，OD260/280比值在1.7～1.9，说明提取种子DNA纯度为佳。DNA浓度控制在0.1～50ng/µL之间，可作相应稀释以调整其浓度。注：用于PCR反应的DNA溶液OD260/OD280比值一般不低于1.5，如低于1.5则重新进行DNA的提取。9实时荧光PCR扩增9.1反应体系按照表2依次加入试剂，配制PCR反应体系，混匀离心分装至PCR反应管中，加入基因组DNA模板，8000r/min离心1min，取出PCR管放入荧光定量PCR仪中。每个PCR反应设置3个平行。表2实时荧光PCR反应体系加量(μL）111BCP（FAM0.4µmol/L）1BSP（JOE5µmol/L）1BUP（ROX1µmol/L）129.2实时荧光PCR反应程序95℃1min；45个循环，95℃5s，60℃35s，在此收集荧光信号，以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪作调整。10结果分析与判定410.1PCR的有效性判定在试样PCR反应的同时，设置如下阴性对照、空白对照和阳性对照。——阴性对照：以三岛柴胡作为阴性对照。PCR体系对应的反应孔均无FAM、JOX，相应Ct值>40.0，有通用探针ROX的荧光信号，且Ct值≤35.0说明PCR体系有效性。——空白对照：以水作为阴性对照。PCR体系对应的反应孔均无FAM、JOX、ROX，说明PCR体系有效性。——阳性对照：以南柴胡/北柴胡DNA（50ng/µL）作为阳性对照。PCR体系对应的反应孔中均有FAM、ROX、JOX，且Ct值≤35.0说明PCR体系有效性。注：每个PCR反应设置3次平行。10.2DNA提取有效性判定在同时进行的空白对照、阴性对照和阳性对照实验结果正常的情况下，被检测样品应有相应荧光信号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，满足Ct值≤35。10.3样品检测结果分析和判定在符合10.2的情况下，使用PCR反应体系对南、北柴胡种子源性成分鉴定：——当羧基荧光素FAM和罗丹染料ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct值≤35说明检出北柴胡种子源性成分；当JOE、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct值≤35说明检出南柴胡种子源性成分。——当只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为伪品柴胡种子；如Ct值>40.0，则判定为未检出相应的源性成分；——如35.0<Ct值≤40.0，则需要重复实验，再次扩增后的Ct值仍<40，且阴性对照和阳性对照结果正常，则判定该样品检出南柴胡或北柴胡种子源性成分；再次扩增后Ct值≥40，且阴性对照和阳性对照结果正常，则判定该样品未检出南柴胡或北柴胡种子源性成分。11检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403-2008规定执行。（规范性附录）仪器设备仪器设备，见表A.1。表A.1仪器设备123电子天平4台式离心机最高转速12000r/min5高压灭菌锅6pH计7磁力搅拌器6（规范性附录）试剂及试剂的配置试剂见表B.1。试剂的配置见表B.2。表B.1试剂123456789表B.2试剂的配置123称取40g氢氧化钠（NaOH）溶于80mL的双蒸水40.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）溶液 7表B.2（续）5610%十六烷基三甲基溴化铵溶液称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）10g，溶解于80mL双蒸水，加热加速溶解，双蒸水定容至100mL，室温保存。7CTAB提取缓冲液取10%CTAB溶液30mL（4.2.7），1mol/LTris-HCl溶液（PH8.0）10mL（4.2.30.5mol/LEDTA（PH8.0）4mL（