蛋白质结构-3课件

体外折叠研究：如：变性和复性体内折叠研究：新生肽链折叠第八节蛋白折叠一蛋白折叠的机制及途径:未折叠蛋白（U）快折叠中间体慢成熟蛋白（N）（一）蛋白折叠的起始：自由能降低过程，为自发性二级结构的形成：首先形成一些忽隐忽现的二级结构。证据来源于蛋白复性实验(二级结构形成<18ms，三级结构形成100~500s)疏水塌缩:蛋白折叠起始缘于疏水力的作用和溶剂挤压效应(hydrophobiccollapse有可能先于二级结构)特殊结构:二硫键等(存在张力)（二）折叠中间态：

熔球态(moltenglobulestate):①具有与天然肽一样的类似紧密程度②二级结构形成，但三级结构未成形③比天然肽具有更多的疏水表面前熔球态(pro-moltenglobulestate):比熔球态松散的结构形态称为“前熔球态”用cytc为实验对象观察到在低离子强度下分子的紧密程度比熔球态弱，几乎所有在天然态中存在的螺旋区域仍停留于二级结构状态。这种结构形态即为前熔球态

熔球态（三）蛋白质折叠的限速步骤：蛋白质的天然构象一般是热力学上最稳定的构象在热力学上最稳定的构象，不一定是动力学上容易达到的构象

限速步骤：①二硫键的形成②Pro的顺反异构化过程AB（N）U能量折叠过程

二蛋白折叠及装配过程中的辅助因子（一）分子伴侣(molecularchaperones)：Ellis提出：把一类在细胞中帮助新生肽链正确折叠,而本身不是最终功能蛋白分子的组成部分的蛋白分子称为分子伴侣进化上十分保守的蛋白，在真核及原核细胞中分布广与酶不同:(1)对靶蛋白不具有高度专一性(2)不具有高效性(3)有时只是阻止肽链的错误折叠，而不促进折叠nucleoplasmin（3）Stress-70(Hsp70):在所有物种中高度保守；单体Mr=70,000所有成员都有一定的ATP酶活性，帮助从靶蛋白上释放功能：识别未折叠或错误折叠的蛋白并以单体形式与其结合，在ATP存在下，帮助正确折叠此外，细胞质中的Hsp70能与核糖体上正在合成的新生肽链结合，使多肽以完全伸展的状态进行跨膜运输。Stress-70家族成员：Dnak，DnaJ（E.coli）;Bip（动物细胞内质网腔）；Scs1P（酵母线粒体）(4)Stress-90：

功能不十分清楚，一般只与少数几种底物蛋白作用，如：几种蛋白激酶，钙调素等(5)分子内伴侣:枯草杆菌的Ser蛋白酶（胞外酶）N信号肽-----前导肽（77aa）------酶蛋白C指导分泌分子内伴侣成熟蛋白（三）分子伴侣的功能①稳定新生肽链未折叠构象，帮助新生肽链正确折叠②帮助寡聚蛋白亚基的正确组装③维持蛋白处于可转运构像，辅助跨膜运输④参与抗逆反应

⑤个别分子伴侣兼有折叠酶的作用：如：E.coli分子伴侣触发因子：脯氨酰异构化酶DnaJ：催化二硫键氧化、还原及异构化（四）折叠酶（foldase）:催化与蛋白折叠直接相关的、对形成功能构象所必须的共价键变化的酶1PDI(proteindisulfideisomerase，蛋白二硫键异构酶)：催化-s-s-反应的酶，位于细胞的内质网管腔中，Mr=58,000PDI是一个最为突出的多功能蛋白:①二硫键异构酶：巯基氧化、二硫键还原和二硫键交换②四聚体Pro-4-羟化酶的(

2β2)的β亚基（防止

亚基错误折叠)③微粒体内甘油三脂转移蛋白复合物(二亚基)的小亚基④一种糖基化位点结合蛋白⑤具有分子伴侣的功能

PDI结构：

为二聚体蛋白，每个单体有五个结构域c：低特异性多肽结合位，分子伴侣功能a、a’：二硫键异构酶活性部位a、a’：二硫键异构酶活性部位核磁共振法（NMR）测定的PDI结构域a和结构域b胱氨酸功能基2.肽基脯氨酰顺反异构酶

(peptidylprolylcis-transisomerase,PPI):分布：具有PPIase活性的蛋白质广泛分布于各种生物体及各种组织中定位：多数定位于细胞胞浆中，但也存在于其它细胞空间，如存在于E.coli的周质间隙、红色面包霉的线粒体基质、酵母与果蝇和哺乳动物细胞的内质网。分类：依照与免疫抑制剂的结合情况环孢霉素亲和蛋白（Cyclosporin）：环孢霉素A结合

FK结合蛋白（FKBP）：FK506及那巴霉素（rapamycin）可与它们结合并抑制其催化活性。在T细胞中：PPIase起抑制T淋巴细胞功能的生理作用。基本作用：是催化蛋白质折叠的起始过程及其Pro顺反异构化的酶。通过非共价键方式稳定扭曲的酰胺过渡态而催化肽酰基脯氨酰基（X-Pro）间的顺式与反式的相互转变。

例如，在碳酸酐酶的折叠中，PPIase一方面在其早期中间体的形成过程中起分子伴侣的作用（阻止不正确的凝聚），另一方面在折叠的较晚时期发挥以上催化活性三蛋白质折叠的研究方法及思路（一）研究思路：1.小肽在水溶液中的构象及其转变：天然小肽，蛋白质同源片段的溶液构象2.变性蛋白的复性：将蛋白质变性，观察复性过程中蛋白质的折叠3.合成不同长度的新生肽片断：

在不同的阶段终止正在核糖体上合成的蛋白质肽链，从而得到一系列不同长度的肽片断（都是以N-端开头），然后观察他们的折叠过程。

（二）研究方法：快速动力学方法与蛋白质空间结构研究方法相结合，捕捉蛋白质折叠的中间状态，拼出折叠过程

快速动力学方法：停流法（stoppedflow）温度跃迁法（temperaturejump）超快光谱法等

蛋白质空间结构研究方法：荧光谱，圆二色谱，氢同位素交换，核(顺)磁共振，激光拉曼谱，付立叶红外光谱（FTIR）等第九节蛋白质结构预测一、基本概念：

一般指找出蛋白质主链上-和-折叠片的位置。广义上说，是计算或找出每个残基所采取的空间构象二、二级结构的描述：１.根据和角与残基构象状态：将=-57º和=-47º为-螺旋

=-140º和=135º为-折叠片非规则结构为无规则卷曲2.根据氢键类型分类：Kabsh和Sander等1983年提出依据：若蛋白质骨架上第i个残基与第i+1个残基之间形成氢键，则定义为“n-回折”。如果仅有一个n-回折，则定义为-转角；若有2个n-回折，则定义为-螺旋；若两个肽片段之间连续3个氨基酸残基有至少两个氢键，则定义为-折叠3.根据微分几何和模式识别理论将肽链骨架看作是一条三维空间曲线，曲线的几何形状由挠率和曲率两个参数描述。-螺旋的挠率和曲率为不变的正值；而-折叠有零值挠率和曲率。三二级结构预测方法：（一）Chou-Fasman法：1974年提出，基于统计学的预测方法，简单，较准确原理：统计了29个已知X-ray晶体结构蛋白中4741aa残基在-helix、-sheet、-turn和coil中出现的频率，调整后得到20种aa形成各种二级结构的倾向因子，分别记作：P

、P

、Pt、PC。由于每种氨基酸在-turn的四个残基处倾向性不同，因此还测定了各自的倾向因子：fi、

fi+1、

fi+2、

fi+3

预测原则：①氨基酸序列中若连续6个残基中有4个易于形成-helix，则被看作是螺旋的起始，然后向两侧扩展到有破坏-helix的4肽为止。任何长于6aa肽片断，形成-helix的倾向因子

P

1.03,P

P

——预测为-helix②若连续3个，或5个中有3个残基利于形成-sheet，则被看作是折叠片的起始，然后向两侧扩展到有破坏-sheet的4肽为止。任何长于6aa肽片断，

P

1.05，P

P

——预测为-sheet③转角形成的概率:Pf=fi

fi+1

fi+2

fi+30.7510-4且：形成转角的平均倾向因子Pt

1.00，P

<PP

——预测为-turn

（二）GOR法：Garnier和Robson提出，基于信息理论基本理论依据：将肽链上一连串的R基侧链看作是一种信息。x—aa的构象状态，y—代表某种特定的aaP(x/y)—y出现后x出现的概率，P(x)—x自身出现的概率则：y在出现x中提供的信息可表示为：

I(x,y)=log

[P(x/y)/

P(x)

]若：y对x无影响，则P(x/y)=P(x)

，并且I(x,y)=0

y有利于x的产生，则P(x/y)

P(x)，I(x,y)

0

y不利于x的产生，则P(x/y)<P(x)，I(x,y)<0若y较复杂，分成若干个相关联或独立的事件，则其信息分解方程扩展为：I(x;y1,y2,···yn)=I(x;y1)+I(x;y2/y1))+I(x;y3/y1,y2)+

···+I(x;yn/y1,y2,···yn-1)若y1，···yn都是独立事件，则上式为各事件引起信息的简单加和；若y1，···yn是相互关联的复杂事件，如代表肽链的序列，则各个aa残基之间是相互影响的。X同样可以分解为多种相关联的事件，将得到极为复杂的信息方程从76个蛋白中统计了12,757个aa残基，根据微分几何二级结构分类法，将各种二级结构描述为4种（螺旋H、折叠E、转角T、无规卷曲C)，对未知序列肽链预测的结果可达60~63%准确率。（三）其它预测方法：基于蛋白质同源性比较物理化学性质：如残基疏水性等能量计算(氨基酸在极性和非极性溶液中的转移能）神经网络方法等准确率：一般：50~60%高：70~80%四蛋白质三级结构预测：原理：热力学方法，统计力学方法，经验统计法统计力学方法：模拟蛋白质折叠过程中的协同特征及相变特征经验统计法：自一级结构预测二级，再按照一定的立体化学原理将二级结构装配成域，然后构建三级结构热力学方法：常用，包括分子力学和分子动力学从已知蛋白结构或核磁共振实验数据出发

根据距离几何方法计算，或同源性比较得到粗结构优化和分子动力学模拟得到精细结构

第十节蛋白质的四级结构一基本概念:寡聚蛋白(oligomerprotein)：两个或多个亚基之间通过非共价键结合在一起多聚蛋白(polymerprotein)：几十个甚至上千个亚基聚合亚基：蛋白质的最小共价单位分子：具有完整功能的最小单位

原体（原聚体）：最小的重复性结构单位

同多聚蛋白：亚基=原体例如：血红蛋白分子(

2β2）；原体（

β）；亚基(或β）不是所有的蛋白都有四级结构二.四级结构的特性四级结构研究内容：亚基的种类、数量及在寡聚蛋白中的空间排布及相互作用。（不包括三级及其以下结构描述）（一）亚基数目及种类：以偶数居多；种类可相同或不同（二）亚基排布与对称性：

1旋转轴与对称表示法：基转角（）：能使物体复原的最小旋转角旋转轴轴次（n）：n=2/

2不对称结构：每个亚基与其相邻亚基相互作用的方式在寡聚蛋白中只出现一次。或，只有旋转360

才能复原的物体。如：核小体中的组蛋白八聚体；核糖体等

3对称结构:

(1)点群对称(pointgroupsymmetry)：

①循环对称（Cn，cyclicsymmetry）：亚基排布在圆圈上，呈平面几何图形二聚体：有C2对称。每个亚基沿轴旋转180（360/2）可与另一个亚基重合，例如固氮酶二组分的铁蛋白，两个亚基成对排列三聚体：有C3对称。每个亚基沿轴旋转120（360/3）可与另一个亚基重合，例如细菌叶绿素蛋白四聚体：有C4对称。每个亚基沿轴旋转90（360/4）可与另一个亚基重合，例如固氮酶的铁钼蛋白C4对称：C6对称：四聚体：有D2对称。即四个亚基按正四面体排布。例如