张凤丽答辩课件

张凤丽答辩重组人IFNα-2b治疗子宫内膜异位症模型的免疫机制研究

02级硕士：张凤丽导师：谢梅青副教授2前言3研究背景子宫内膜异位症(简称内异症)是育龄妇女的常见病，痛经、不孕为其主要临床表现。EM发病率约10%～15%。不孕妇女中：EM发病率30%～50%。EM中不孕的发病率为25%～35%。在慢性盆腔痛患者中经腹腔镜检证实有30%～50%是内异症。

---内异症严重影响了妇女的身心健康4研究背景－内异症的病因学说经血逆流学说—经典学说

体腔上皮化生学说良性转移学说环境学说基因学说免疫学说－－－研究热点

5研究背景－内异症的病因学说研究表明76%～90%生育年龄妇女会发生经血逆流,但只有10%～15%的妇女患子宫内膜异位症。1980年，Weed和Arquemboug就指出子宫内膜异位症是一种与自身免疫有关的疾病。6研究背景－内异症的病因学说2001年，Nothnick称内异症为一种自身免疫性疾病。目前学者们认为免疫系统的异常对于子宫内膜异位症的种植、粘附、生长等各个环节起着重要作用。---免疫学说已获得普遍认同7研究背景－内异症与细胞免疫T淋巴细胞是机体产生特异性细胞免疫应答的重要细胞： CD3+代表全部T淋巴细胞；CD4+代表辅助性T细胞(Th)；CD8+代表细胞毒性T细胞(Tc)和抑制性T细胞(Ts)；T淋巴细胞各亚群失衡－－免疫系统改变8研究背景－内异症与细胞免疫众多研究发现：

内异症患者血清、腹腔液中的CD3、CD4比率及CD4/CD8比值降低，Th与Ts细胞比例失衡，CD4/CD8比值倒置，指出子宫内膜异位症的发生、发展与患者的细胞免疫功能低下有关。---内异症患者多存在细胞免疫功能缺陷或低下9研究背景－内异症与体液免疫目前国内外学者也证明了内异症患者体内存在下列抗体增多：

非器官特异性的抗体：抗多核苷酸类、抗组蛋白及抗磷脂、心脂类抗体、抗Laminin-1抗体等

器官特异性抗体：AOA、AEA等

---内异症患者存在体液免疫反应增强10研究背景－内异症与细胞因子活化的CD4+辅助细胞分为：

Th1细胞：IL-2、IL-12和干扰素-γ等，反映机体的细胞免疫状态；Th2细胞：IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等,反映机体的体液免疫状态Th1/Th2细胞因子动态失衡－－疾病发生11研究背景－内异症与细胞因子目前发现，内异症患者：

Th1/Th2细胞分泌的细胞因子水平发生了转变，Th1/Th2失衡，Th1向Th2漂移，使子宫内膜能够逃避免疫监视及杀伤而在异位种植，引起内异症的发生发展。

---内异症存在Ｔｈ1/Ｔｈ2失衡12研究背景－内异症的治疗

药物

性激素

：

抗性激素类：

手术：

---此两种方法均没有考虑到内异症患者整体免疫状态的调节不良反应多，复发率高，五年复发率均在40％左右，效果不理想。单纯切除病灶、术后复发率高，易造成新粘连。13研究背景－内异症的免疫治疗内异症的免疫病因学研究进展：改善机体的免疫功能－－新的EM治疗法------免疫调节剂目前一些免疫抑制剂：

如corticoids(类皮质激素)、indomethacin(消炎痛)、pentoxifylline(已酮可可碱)等

------其副反应较大，在临床上受到限制14研究背景－内异症的免疫治疗

抗病毒、抗肿瘤干扰素：增强巨噬细胞的功能、提高NK细胞活性减少IgE的产生、调节机体免疫功能

---开始在实验室及临床应用于内异症15研究背景－内异症的免疫治疗1999年，IngelmoJM等发现IFNα-2b腹腔或皮下注射干扰素治疗内异症模型，发现异位病灶明显缩小；2000年,BahaFateen等采取腹腔内一次性置入IFNα-2b治疗EM患者，复发率降低，妊娠率提高，推测干扰素可用于内异症的治疗。2001年，ShawkyZ.A及2005年，NishidaM等体外也发现：IFN可抑制异位子宫内膜细胞的DNA合成，促进异位子宫内膜细胞凋亡。

---干扰素可作为一种免疫调节剂用于内异症的治疗16研究背景－内异症的免疫治疗总结：IngelmoJM实验只是单纯从用药前后病灶大小来推测干扰素治疗效果，用药的时间过短，而BahaFateen的实验也是一次性腹腔用药，ShawkyZ.A及

NishidaM的实验都是一些体外研究。

---干扰素治疗内异症的具体机理是？17研究立题本研究拟建立SD大鼠子宫内膜异位症模型，通过不同用药途径观察重组人IFNα-2ｂ对内异症异位病灶的作用，并检测内异症大鼠治疗后细胞免疫和体液免疫的多项指标，探讨重组人IFNα-2ｂ治疗子宫内膜异位症的可行性及临床应用前景。18研究目的：1.通过成功建立SD大鼠子宫内膜异位症模型，为研究重组人IFNα-2b对此病的治疗效果提供良好的基础。2.研究重组人IFNα-2b不同治疗方案对SD大鼠子宫内膜异位症模型病灶的发生和发展的抑制作用，探索内异症免疫治疗的新方法。

3.研究重组人IFNα-2b对大鼠子宫内膜异位症模型细胞免疫及体液免疫功能的影响，探讨治疗机理。19材料与方法20实验步骤及方法大鼠建模随机分组成功后F组

同时药物干预E组G组D组C组B组A组测量用药后病灶大小用药四周后，处死大鼠取血清、全血及病灶流式测定T淋巴细胞亚群血清IgG、IgA、IgM的测定

血清IL-2、IL-4的测定

取异位病灶及盆腔脏器做病理药物、安慰剂干预或不干预21实验方法－动物模型的建立

自体移植（粘膜面裸露）法

移植物成功的指标为：

肉眼观：体积明显增大，呈隆起透亮的囊泡状，内部充满淡黄色或清亮积液，或形成灰白色小结，部分移植物被结缔组织覆盖，表面血管清晰可见。

病理示：具有内膜上皮细胞、腺体及间质细胞,部分可见到分泌活动。22实验方法－动物模型的建立分组与用药：

选择异位病灶生长良好的大鼠48只，按异位病灶大小分层随机法分为五组。E、F组在建模的同时向腹腔内放入不同剂量的干扰素:

A组：腹腔持续应用干扰素组(ｎ=12):10万单位/次,q2w×4w

B组：皮下持续应用干扰素组(ｎ=12)：剂量同上C组：腹腔内注射空白对照组(ｎ=8)：NS0.5ml/次,q2w×4w23实验方法－动物模型的建立D组：皮下注射空白对照组（n=8）：剂量同上

E组：腹腔单剂量置入干扰素α-2b60万单位组(ｎ=12)F组：腹腔单剂量置入干扰素α-2b120万单位组(ｎ=12)G组：模型空白对照组（n=8）

于用药四周后处死大鼠，取组织及血液待检24实验方法－移植物肉眼观

于用药前后用两脚规测量移植物大小，观察前后体积（V＝长×宽×高）变化，并与对照组相比较。

25实验方法－病理检查

在用药前、后分别随机取部分异位病灶组织，处死大鼠时取肝脏、肾脏脏器连同在位内膜做病理观察，观察干扰素对异位病灶的影响及对脏器器官的改变。

26实验方法全血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的测定：

流式细胞仪测定法血清IgG、IgA、IgM含量的测定：

免疫比浊法血清IL-2、IL-4的测定：

ELISA法27统计结果用Ｘ±s表示，数据用SPSS11.0统计软件处理，组间比较用方差分析及配对t检验，各组之间两两比较用LSD方法，若方差不齐用Tamhane检验。各组生长率相互比较用R×C四格表比较，

P＜0.05为差异有显著性。28结果291、动物模型制备情况

动物建模后的生长情况

52只SD大鼠有48只建模成功，成功率为92.3％，各个移植部位的异位内膜生长情况不同：

表1.1.1未干预时SD大鼠内异症模型异位病灶的生长率

建模位置建模例数生长例数生长率（%）左卵巢系膜484083.3左子宫系膜483777.1小肠系膜483675右腹壁484287.5合计19215580.7301、动物模型制备情况-移植物肉眼观

建模成功的病灶（小肠系膜上）

建模成功的病灶（卵巢旁）311、

动物模型制备情况-病理学改变未干预前异位病灶病理改变：异位病灶上皮细胞呈高柱状生长，内膜上皮细胞见核下空泡异位内腺体数目多，腺腔大，腺上皮呈柱状或乳头状，增生现象明显

322、重组人IFNα-2b对异位内膜干预时模型的制备情况:

图2.1未用药时与干扰素干预时各个移植部位的异位内膜生长情况

333、重组人IFNα-2b对子宫内膜异位症模型大鼠异位内膜的影响

34图3.1重组人干扰素α-2b用药后肉眼观察移植物体积变化

*P<0.05与对照组用药前后比较；※P<0.05与自组用药前比；＃A、B组用药前比较35图3.2重组人IFNα-2b持续用药组对异位内膜病理学的影响

干扰素皮下持续用药后的异位内膜上皮及腺体上皮细胞呈单层分布×40

干扰素腹腔持续用药后异位内膜上皮细胞坏死脱落×4036图3.3重组人IFNα-2b单剂量置入组对异位内膜病理学的影响E组用药后异位内膜上皮呈单层，部分细胞已脱落×40E组用药后部分上皮细胞仍呈立方状分布，核深染，核仁明显×40F组上皮细胞部分脱离×40E组在位内膜无明显变化×40374.重组人IFNα-2b对子宫内膜异位症模型大鼠血浆CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴细胞的影响

38图4.1

各组大鼠血浆CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴细胞水平

395、重组人IFNα-2b对子宫内膜异位症模型大鼠血清IgG、IgA、IgM的影响

40图5.1各组大鼠血清IgG、IgA、IgM水平*P<0.05,与C、D、G组比较416、重组人IFNα-2b对子宫内膜异位症模型大鼠细胞因子IL-2、IL-4的影响

42图6.1各组大鼠血清IL-2、IL-4水平

*P<0.05与对照组相比较；▲P<0.05与E组相比较；＃P<0.05与F组相比较43*P<0.05与对照组相比较；▲P<0.05与E组相比较；＃P<0.05与F组相比较图6.2各组大鼠血清IL-2/IL-4比值

447、重组人IFNα-2b对内异症大鼠肝脏、肾脏的病理影响

干扰素用药后肝脏、肾脏未发生明显病理改变45讨论46关于子宫内膜异位症动物模型的

建立及意义

自发性子宫内膜异位症模型

如恒河猴、南美猕猴、狒狒等－－发病率低，饲养条件高，观察周期长，在研究应用方面受到限制。

移植性子宫内膜异位症模型如裸鼠、SCID小鼠－－不适于研究机体免疫方面。47关于子宫内膜异位症动物模型的

建立及意义诱发性子宫内膜异位症模型猕猴－－价格昂贵,不易普及；

兔子－－主要应用于研究内异症对卵子释放、拾卵、卵子运送的影响；

大鼠－－性激素水平较高，动情周期短且规律，繁殖能力快，为经济型动物，且模型容易建立，成功率高。48本课题主要是从免疫调节方面探讨重组人干扰素α-2b治疗大鼠内异症模型的机理，因此采用了SD大鼠制备的EM模型。建模时间：在动情期或动情前后期；建模方法：自体移植法依据学说：子宫内膜种植学说；建模部位－－临床好发部位------总建模率为92.3％

比RajkumarK等报道的75％～85％造模成功率高；郑澄宇等报道的65%造模成功率高

模型的成功建立为研究干扰素对此病的影响及观察其治疗效果提供了良好的基础

49重组人IFNα-2b持续用药对内异症模型

大鼠异位内膜的影响

本研究发现重组人IFNα-2b腹腔注射或皮下注射10万单位持续用药可使内异症模型大鼠异位病灶体积明显缩小。镜下见异位子宫内膜腺体和间质减少，上皮细胞呈扁平状或坏死脱离，内异症大鼠的正位子宫内膜也部分出现异位上皮细胞的萎缩，盆腔内粘连减轻。50重组人IFNα-2b持续用药对内异症模型

大鼠异位内膜的影响推测IFN连续用药可促进异位子宫内膜的萎缩，对子宫内膜异位症的治疗效果良好，皮下用药与腹腔用药对异位内膜的影响结果相似。提示在临床上我们可以采取较简便的应用方法－皮下用药法来达到同样的治疗效果。51重组人IFNα-2b单剂量用药对SD大鼠

内异症模型的成模干预作用

本研究发现在异位内膜形成前单剂量应用重组人IFNα-2b可明显降低异位内膜的存活率，120万单位对异位病灶的抑制效果更明显。病理显示存活的异位内膜腺体和间质减少，部分有明显萎缩。但也有部分病灶呈增生现象。我们可以推测在异位内膜种植于腹腔内尚未形成异位病灶之前，预防应用干扰素可以防止子宫内膜异位症的发生发展。

52重组人IFNα-2b持续用药对内异症

大鼠细胞免疫功能的影响

本研究发现重组人IFNα-2b连续使用四周后，血清CD3+、CD4＋百分率及CD4+/CD8+比值均见明显升高，提示干扰素治疗后，内异症大鼠体内Th增多，Ts减少，提高了内异症模型大鼠细胞免疫功能状态，加强了机体对异位内膜的排斥作用，推测这可能是干扰素持续用药有效治疗内异症、降低其复发率的机理之一。

53重组人IFNα-2b单剂量用药对内异症大鼠细胞免疫功能的影响本研究发现重组人IFNα-2b单剂量应用后CD4＋T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值明显升高

，与重组人IFNα-2b持续用药组相比CD3＋、CD4＋T淋巴细胞亚群百分率降低。提示：内异症发生之前应用干扰素可调整机体整体免疫水平，从而得以减轻延缓内异症的发生发展。54重组人IFNα-2b单剂量用药对内异症大鼠细胞免疫功能的影响重组人IFNα-2b持续用药较单剂量用药对改善机体的细胞免疫功能效果更好，可能是重组人IFNα-2b用药时间与机体免疫力呈正相关有关。通过本实验可推荐，测定T细胞亚群对于内异症的疗效观察及预后判断具有一定的临床意义。55重组人IFNα-2b对内异症大鼠

血清IgG、IgA、IgM的影响

本实验发现重组人IFNα-2b连续用药降低了内异症大鼠IgG、IgA

水平，推测可能在一定程度上降低了内异症模型大鼠过高的体液免疫功能。预防性应用重组人IFNα-2b可能是抑制了大鼠过高体液免疫的发生，从而阻止了内异症的发生及发展。

56重组人IFNα-2b持续用药对内异症大鼠

血清IL-2、IL-4的影响

本研究发现重组人IFNα-2b连续用药后内异症模型大鼠IL-2水平明显升高,IL-2的升高维持了机体的正常免疫功能。IL-2/IL-4比值的升高提示:重组人IFNα-2b可能逆转了Th1型向Th2型偏移,恢复了Th1/Th2之间的平衡，这也可能是重组人干扰素α-2b持续用药对内异症治疗作用机理之一。

57重组人IFNα-2b单剂量用药对内异症大鼠血清IL-2、IL-4的影响研究表明预防性应用单剂量重组人IFNα-2b不足以以刺激Th1型细胞活化或使活化的T淋巴细胞产生细胞因子。重组人IFNα-2b单剂量的置入预防性地减少了Th2细胞因子的产生，从而预防了Th1型细胞因子向Th2偏移，此可能是预防内异症发生发展的机理之一。

58重组人IFNα-2b单剂量用药对内异症大鼠血清IL-2、IL-4的影响临床上，内异症手术后的复发率50％左右，根据本实验结果推测手术后预防性腹腔内放置重组人IFNα-2b可能会预防内异症的复发。

59重组人IFNα-2b对内异症大鼠

肝脏、肾脏的影响

重组人IFNα-2b持续用药或单剂量用药，内异症大鼠的肝脏及肾脏组织未出现明显病理变化，推测单剂量或连续应用重组人IFNα-2b还不足以导致机体脏器发生器质性改变，但是否对内异症大鼠造成远期影响还需进一步探讨。

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