研究肝癌中net-1基因与p27及其磷酸化降解分子的相关性课件

研究肝癌中net-1基因与p27及其磷酸化降解分子的相关性原发性肝细胞肝癌(HCC)是高度恶性的肿瘤,2000年全球有62.6万人发病,死亡59.8万人,其中约55％发生在中国,其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。南通启东地区是世界卫生组织确定的肝癌高发研究现场。

HCC的发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此,进一步探索研究新的基因功能改变与HCC发生、发展及其恶性特征的关系,设计合理的治疗药物及判断预后,在提高我国HCC的诊治水平中具有重要意义。

NET-1与NET-2到NET-7一起统称为NET-X,它们是由Serru等于2000年在EST数据库中发现的7个新的含4次跨膜蛋白超家族(transmembrane4superfamily或tetraspanfamily,简称TM4SF)的成员。

NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1)

定位于染色体1p34.1上,其mRNA全长为1297bp(基因库登记号码AF065388),为TM4SF的成员之一,最近证实其为肿瘤相关基因。

p27作为细胞周期重要负性调控因子,受多种因素调控。细胞外信号调节激酶(ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)中一条主要和经典的并与人类癌症关系最为密切的途径,p27蛋白是ERK信号通路下游的重要分子。p27的基因突变非常罕见,对p27的功能调控主要发生于转录后阶段,通过蛋白磷酸化修饰来发挥其生物学效应。p27分子内存在数十个潜在的磷酸化位点,其中以N端第10位丝氨酸(S10)及C端第187位苏氨酸(T187)最为重要,占p27蛋白总磷酸化水平70﹪以上。p-p27T187可启动S期激酶相关蛋白2(Skp2)分子介导的p27多聚泛素化及随后降解。有证据显示JAB1与p27的出核转运有关。它能够促进p27从胞核向胞浆的移位,加速p27泛素蛋白酶体途径的降解

。1、构建重组表达质粒NET-1siRNA、myc-NET-1和pEGFP-myc-p27(WT)。2、细胞培养与转染3、Westernblot检测蛋白表达4、免疫共沉淀分析NET-1与p27的相互作用关系5、免疫组化检测

6、临床病例与预后分析一、材料与方法二、结果1、NET-1对细胞周期相关蛋白p27、p-p27T187、Skp2、ERK、p-ERK及PCNA表达的影响GFP抗体检测结果显示除未处理组外,转染myc-p27和pEGFP-N组中均有显著的GFP表达,表明在转染后SMMC-7721细胞中表达外源性p27(line1)。p27抗体检测结果显示各组细胞中均表达p27,但在转染myc-p27组中显著增加,表明转入外源性p27可以增强内源性p27的表达(line2)。免疫共沉淀的结果显示在SMMC-7721细胞中GFP-p27可以与myc-NET-1一起,共同被抗myc抗体免疫沉淀下来。提示p27与NET-1存在相互作用。5﹪的全细胞裂解液用于阳性对照。2、p27与NET-1在肝癌SMMC-7721细胞中存在相互作用NET-1阳性率为97.3﹪Ki67阳性率为94.7﹪3、HCC中NET-1蛋白表达与Ki67表达NET-1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA、及JAB1均在癌中高表达。p27均在癌旁核内高表达。4、HCC组织和癌旁组织中NET-1/p27的表达NET-1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA、及JAB1均在癌中高表达。p27均在癌旁核内高表达。HCC组织和癌旁组织中NET-1/p27的表达癌中癌旁NET-1在HCC、癌旁组织和血管瘤旁肝组织中表达呈递减趋势,不同组间的差异均有显著的统计学意义。JAB1、p-p27T187、p-p27S10和PCNA在HCC中表达显著高于癌旁组织和血管瘤旁肝组织,但后两组间差异无显著统计学意义;p27在癌旁组织和血管瘤旁肝组织中表达显著高于HCC中,但前两组间差异无显著统计学意义。

5、NET-1、PCNA、p27及其相关分子在HCC、癌旁组织和正常肝组织中表达

(1)NET-1与p27Kip1的表达呈负相关(r﹦－0.6078,P<0.001)(2)NET-1与JAB1的表达则成正相关(r﹦0.6866,P<0.001)(3)NET-1与PCNA的表达则成正相关(r﹦0.5645,P<0.001)6、HCC中NET-1、PCNA、p27及其相关分子表达的相关性(1)Log-rank单因素分析影响预后的因素:癌淋巴结转移与NET-1、p27、PCNA、p-p27T187p-p27S10表达。7、NET-1、PCNA、JAB1、p27、p-p27T187、p-p27S10表达与HCC预后的关系(2)Kaplan-Meier生存曲线

NET-1高表达组五年生存率(28.6﹪)显著低于低表达组(59.4﹪)(P<0.01NET-1高表达伴p27低表达时五年生存率(13.6﹪)显著低于其他组(57.8﹪)(P<0.01)。(3)Cox比例风险模型多因素生存分析HCC淋巴结转移、组织学分级,癌中NET-1、JAB1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA表达均具有独立的预后意义。风险分析提示这些因素增强时均能增加HCC病人的死亡风险(其风险比均＞1)本研究结果显示上述质粒的构建完全符合设计预期,通过转染针对Lamin的siRNAs后出现的较显著沉默Lamin基因的效果,表明本研究进行的siRNAs递送、转染以及反应条件符合要求。Western-Blot结果显示干扰NET-1表达后p27表达增高,Skp2、p-ERK及PCNA表达降低;相反,增加NET-1表达使p27表达降低,Skp2、p-ERK及PCNA表达增加。提示NET-1可能参与ERK信号级联通路的激活过程。免疫共沉淀结果也证明了NET-1与p27之间可以相互作用,并且外源性p27可以增加内源性p27的表达。推测NET-1激活ERK,促使其发生磷酸化而活化,使控制细胞进入S期的p27下调,引起p27降解相关的磷酸化蛋白增加,从而引发细胞周期调控紊乱是NET-1与p27之间可能的作用机制。三、讨论免疫共沉淀和免疫组化结果证实NET-1与p27呈负相关。支持NET-1的表达能抑制p27对细胞周期的负性调控。本文中NET-1与JAB1的表达呈显著正相关,未见到NET-1与p-p27T187和p-p27S10之间存在相关性,提示NET-1与p27的相关性还可以通过与JAB1相关通路。本文在HCC预后的分析中显示除了临床上肿瘤脉管转移与预后相关外,NET-1、p27、JAB1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA均是显著影响癌患者预后的独立指标,当这些指标高表达或p27低表达时患者死亡的风险增加。特别在NET-1高表达伴有p27低表达时的5年存活率13.6﹪显著低于其他组57.8﹪。因此检测HCC中NET-1的表达具有预后评