小麦原生质体分离及转化实验方法

小麦原生质体分离及转化1.需要准备的器材名称名称名称剃须刀片100um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形瓶名称名称名称剃须刀片100um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形瓶离心机(水平转子)滤布圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器六孔板50ml圆底离心管六孔板材料准备小麦苗的培养，种小麦种子于培养室，置于温度25±2°C，光照度1000Lx,光照14〜16h/d的条件下培养。先光照培养7天再暗培养7-10天。原生质体分离取小麦幼嫩的叶片，用刀片将其中间部分切成0.5-1mm的丝，放入0.6M的Mannitol溶液中避光处理10分钟，再用滤网过滤，将其放入50ml酶液中消化5小时(先静止酶解0.5h，再10rmp缓慢摇晃4.5h)。(注：酶解温度要保持在20-25°C，且要避光，酶解完轻轻摇晃酶解液，使原生质体释放出来。)加10mlW5稀释酶解产物，用100um尼龙滤膜过滤酶解液于圆底离心管中(50ml)。(注：尼龙滤膜要浸泡在75%酒精里，用时要用水冲洗，再用W5浸泡2min再过滤。)23C，80g，升3降3，离心3min，弃上清。(注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。)用W510ml轻轻悬起，23C，80g，升3降3，离心3min，弃上清。用W510ml轻轻悬起冰上放置30min，原生质体逐渐沉降，23C，80g，升3降3，离心3min，弃上清。加适量MMG悬浮，至于冰上，待转化。(注：此时需要确定原生质体的浓度，镜检(X100),原生质体数为2X105/ml---1X106/ml.吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害。)小麦原生质体转化加20ug质粒于10ml离心管，用去尖的枪头吸取200ul原生质体轻弹混匀，静止3-5min，再加200ulPEG4000，轻弹混匀，避光诱导转化10min；加1760ulW5(室温)颠倒混匀，80g，升3降3，离心3min，弃上清；加1mlW5，颠倒混匀，轻轻转至6孔板中，已预先加入1mlW5,23°C培养过夜。6孔板先使用5%NBS包被。溶液配制酶解液：(1.5%CellulaseR-10,0.3%MacerozymeR-10,0.6Mmannitol,10mMMESatpH5.7,1mMCaCl2and0.1%BSA)W5：(154mMNaCl,125mMCaCl2,5mMKCland4mMMESatpH5.7)MMG:(0.4Mmannitol,15mMCaCl2and4mMMESatpH5.7)PEG：(40%(W/V)PEG4000;Fluka,0.2Mmannitoland0.1MCaCl2)具体配置如下：(1)50ml酶解液(现用现配)试剂加入量终浓度CellulaseR100.75g1.5%MacerozymeR100.375g0.75%Mannitol5.4651g0.6MMES0.1066g10mM定容至50ml，KOH调pH值为5.7；55C水浴10分钟，室温自然冷却后再加CaCl20.0735g10mMBSA0.05g0.1%用0.45um滤膜过滤(2)500mlW5试剂加入量终浓度

NaCl4.5g154mMCaCl29.189g125mMKCl0.1864g5mMMES0.2132g2mM定容至500ml,NaOH调pH为5.7(3)250mlWI试剂加入量终浓度Mannitol22.77g(MW182.17)0.5MKCl0.3728g20mMMES0.2132g4mM定容到250ml,KOH调pH至5.7，用0.45um滤膜过滤（4）10mlMMG溶液（现用现配）试剂加入量终浓度Mannitol(0.8M)5ml0.4MMgCl2(1M)0.15ml15mMMES(200mM)0.2ml4mMDDW定容至10ml（5）4mlPEG溶液（现用现配）试剂加入量终浓度PEG40001.6g40%Mannitol(0.8M)1ml0.2MCaCl2(1M)0.4ml0.1MDDW定容至4ml（5）母液配制（100ml，4°C）

名称 称取试剂量（100mL）分子量（MW）0.8MMannitol 14.5736g182.172