激光显微镜课件

激光扫描共聚焦显微镜目录CONTENTPART

ONEPART

TWOPART

THREEPART

FOURPART

FIVEPART

SIX背景特点结构原理优势应用PART

ONE背景PARTONE选题背景LSCM激光扫描共聚焦显微镜PARTTWO特点PARTTWO特点1、光学分层能力其光学分层能力，即获得特定深度下焦点内的图像。图像通过逐点采集，以及之后的计算机重构而成。因此它可以重建拓扑结构复杂的物体。对于不透明样品，可以进行外表作图，而对于透明样品，那么可以进行内部结构成像。2、内部结构成像内部结构成像上，图像质量在单台显微镜中就可以得到极大的提升，因为来自样品不同深度的信息未被重叠。其主要特点是可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构。PARTTHREE结构PARTTHREE结构激光扫描共聚焦显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。在结构配置上，激光扫描共聚焦显微镜除了包括普通光学显微镜的根本构造外，还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统(包括数据采集、处理、转换、应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等局部。PARTTHREE结构照明针孔使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与探测器针孔及焦平面形成共聚焦装置。物镜探测器针孔起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息〔两点共轭〕。光电倍增管〔探测器〕接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。激光器可以根据研究究需要选择不同的激光器。一个完整的LSCM系统由几个主要的硬件和一些成像分析软件组成。硬件包括外表荧光显微镜、激光光源及冷却系统、定位扫描装置、分辨系统、计算机控制系统、显示器和图像输出打印设备，软件由三维图像分析系统和三维图像文件管理系统构成。PART

FOUR原理工作原理：在传统光学显微镜根底上，激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，传统显微镜能“看〞到所有能被光投身到地方，而对于共聚焦显微镜，只有焦点处的信息被采集。实际上共聚焦激光扫描显微是通过对焦点深度的控制和高度限制来实现的。并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。激光共聚焦扫描显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管〔PMT〕探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。PARTFOUR原理PARTFIVE优势PARTFIVE优势PARTFIVE优势图像处理三维定位LSCM利用共聚焦系统有效的排除了焦点以外的光信号干扰，提高了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，到达了三维空间定位捕捉信号由于LSCM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径。PARTSIX应用PARTSIX应用PARTSIX应用组织和细胞中的定量荧光测定细胞间通讯的研究；细胞物理化学测定实时成像，可进行活细胞跟踪三维重构及定量分析。细胞内钙离子和pH值动态分析。离子成像/比率成像，可进行Ca2+,Mg2+,H+,Na+,K+,Zn2+,Ni2+,Fe2+,Hg2+,Pb2+及Cd2+等成像PARTSIX应用激光扫描共聚焦显微镜应用照明针与检测孔共轭成像，有效抑制了焦外模糊成像并可对标本各层分别成像，对活细胞行无损伤的“光学切片”这种功能也被形象的称为“显微CT”。CLSM还可以对贴壁的单个细胞或细胞群的胞内、胞外荧光作定位、定性、定量及实时分析，并对胞内成分如线粒体、内质网、高尔基体、DNA、RNA、Ca2+、Mg2+、Na+等的分布、含量等进行测定及动态观察，使细胞结构和功能方面的研究达到分子水平。在细胞及分子生物学基础研究中的应用普通显微镜及电子显微镜，仅能对肿瘤相关抗原进行定性分析，而CLSM则可对单标记或者多标记细胞、组织标本及活细胞进行重复性极佳的荧光定量分析，从而对肿瘤细胞的抗原表达、细胞结构特征，抗肿瘤药物的作用及机制等方面定量化。在肿瘤和抗癌药物筛选研究中的应用激光扫描共聚焦显微镜观察免疫细胞和系统，如树突状细胞、单核-吞噬细胞系统、自然杀伤细胞、淋巴细胞时，在准确细胞定位的同时有效鉴定免疫细胞的性质。在血液病学和医学免疫学研究中的应用激光扫描共聚焦显微镜分层扫描发现神经轴突的内部结构连续性好。用激光扫描共聚焦显微镜能观察到脑干组织中神经轴突的正常走向，可排除在荧光显微镜下由此造成的一些病理假象。并且激光扫描共聚焦显微镜能观察神经轴突的三维结构，因此应用CLSM有可能观察到普通光镜下未能发现的神经组织的细微病变。在大脑和神经科学中的应用利用激光扫描共聚焦显微镜可以观察晶状体，角膜、视网膜、虹膜和睫状体的结构和病理变化。在眼科研究中的应用激光扫描共聚焦显微镜在骨科研究领域的应用现状表明，CLSM在观测骨细胞形态学研究、骨细胞特异性蛋白（骨钙素）以及骨细胞之间的相互作用具有显著的优势。在骨科研究领域中的应用123456THEEND主要结论THEEND主要结论结论优点激光扫描共聚焦显微镜是近80年代以来开展起来的高科技医学图像分析仪器，与传统的荧光显微镜相比，分辨率有了进一步