高效液相色谱

第九章高效液相色谱

1906年，俄国生化学家茨维特第一个运用玻璃柱分离植物色素，并取得较好的分离效果，成为世界公认的液相色谱的奠基人。但受当时技术条件的限制，这种经典的柱色谱由于柱效、回收率、重现性等因素的影响，未能迅速发展直到20世纪60年代末70年代初，人们将GC色谱的原理引进液相色谱以后，才演变成今天的分离性能好、分离速度快、使用范围广的高效液相色谱（HPLChighperformanceliquidchromatography）高效液相色谱的简史整理ppt整理ppt第一节基本原理整理ppt1、样品不必气化2、分离温度低3、选择性好4、样品回收容易5、分离效果好一、HPLC的特点整理ppt整理ppt整理ppt

据不完全统计，目前全世界已知的天然和合成的化合物有超过500万种以上，其中70~80%化合物可用HPLC分析，而只有20%可用GC分析如:1.利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离小麦胚乳醇溶蛋白2.武汉化工学院测试中心:采用高效液相色谱法,在C18柱上,以甲醇—乙酸乙酯(95：5,体积分数)为流动相,检测器波长为275nm,测定了维生素A醋酸酯,维生素D3和维生素E醋酸酯的含量

整理ppt二、HPLC的分类1、高效液-固吸附色谱2、高效液-液分配色谱3、高效离子交换色谱4、高效离子对色谱5、高效排阻色谱整理ppt

三、HPLC的分离原理1、高效液-固吸附色谱根据吸附与解吸附机制。首先，样品组分吸附于固定相，再用流动相（洗脱剂）进行洗脱时，使这种吸附作用解离，样品组分随流动相洗脱出柱整理ppt2、高效液-液分配色谱

根据各组分在两液相（固定相和流动相）中的分配系数的不同进行分离分配系数K=整理ppt

在色谱系统中存在互不相溶的两相，一为固定相，一为流动相。当组分在固定相和流动相中分配达到平衡时，若某一组分在流动相中的浓度大于固定相中的浓度，则此组分必然先被洗脱出柱，即在色谱图中先出峰；相反，若某一组分在固定相中的浓度大于流动相中的浓度，则此组分洗脱所需要的时间较长，在色谱柱中保留的时间较长，在色谱图中后出峰整理ppt整理ppt

3、高效离子交换色谱

离子交换剂包括可交换离子和离子基，如某一组分的被交换离子与离子基的相互作用强，则可被交换，洗脱需时间就长；反之，不能被交换的物质则随着洗脱液与可交换组分分离开

整理ppt4、高效离子对色谱

在流动相或固定相中加入与组分分子电荷相反的离子（配对离子），使之与组分离子结合，生成在水中不解离的化合物，迅速转移到有机相中整理ppt5、高效排阻色谱

凝胶色谱原理；分子筛效应

整理ppt1、输液系统2、进样系统3、分离系统4、检测系统5、数据处理系统四、HPLC仪的结构组成整理ppt整理ppt1、输液系统

流动相贮存器高压泵

梯度仪

高压流动相通过色谱柱，可降低由于样品在柱中的扩散效应、边缘效应而导致伸舌峰、拖尾峰的出现(提高了柱效和分辨率)可使流动相随固定相和样品性质的改变而改变，如洗脱液的极性，离子强度、pH值等，便于各种组分均能获得有效分离整理ppt2、进样系统进样装置

定量环

注射器进样

进样阀进样

特点：简单、方便、价格便宜、进样量容易改变；但不适合高压（＞10MPa）进样，否则注射器爆裂适于高压操作，进样量比较精确，重复性好整理ppt3、分离系统

色谱柱

连接器

柱温箱

分离系统的核心装置上接输液泵，进样阀，下接检测器（不得泄露）

保证整个分离过程在一个适于组分分离的恒定条件下进行，因为温度变化会使tR发生改变（空气浴±1℃循环水浴：±0.1℃以内）整理ppt整理ppt整理ppt4、检测系统检测器

----检测由色谱柱洗脱下来的组分，根据其洗脱的先后顺序在色谱图中出峰，以tR表示洗脱的难易程度，以色谱峰的峰面积A表示组分含量（有时用峰高H）整理ppt整理ppt5、数据处理系统

此系统负责对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理如外标法中，测得对照品和供试品的峰面积，根据对照品溶液的浓度即可计算出样品浓度整理ppt五、色谱柱

根据制备方法不同分为填充柱和毛细管柱；其中最常用的是刚质填充柱，其填料即为带有固定相的担体。以微粒硅胶为基质的化学键合相是目前液相色谱法中应用最广泛的固定相。如RP-HPLC中运用最广泛的十八烷基键合硅胶（ODS）即是将一层细的丙烯桥双配位C18硅烷键合到硅胶上，可有效抑制硅胶在高PH条件下溶解，拓宽硅胶的稳定范围（PH2~11.5）。另外，ODS键合烷基C18链较长，对碳载量和溶质的保留值都增高常用色谱柱的内径为4.6mm柱长15~25cm（4.6×25）整理ppt六、流动相

在RP-HPLC中，流动相为水和有机溶剂组成的混合溶液整理ppt流动相的要求（1）各种有机溶剂尽可能用“色谱纯”或“HPLC用”的溶剂；水最好用超纯水或重蒸馏水；如果流动相含盐，应将配好的流动相经0.4μm或0.22μm的滤膜过滤后再用（2）使用前应进行脱气处理，否则分离效果不好，并且易损伤色谱柱（3）流动相应避免过酸或过碱，一般PH使用范围2.5~7.5；因为以硅胶为基质的键合固定相对酸和碱较敏感（4）性质稳定,不与固定相发生不可逆的化学反应（5）与检测器相匹配，对检测不产生干扰（6）对样品有适当的溶解度；通常以流动相为溶剂溶解供试品制备供试品溶液，这样在色谱图上就没有溶剂峰（7）沸点低，且不易聚合；这样回收样品较容易整理ppt八、与HPLC相关的概念及基本理论整理ppt(1)

概念：1、基线

指只有流动相通过检测器时所得到的信号，通常为一水平直线，是检测色谱仪正常与否的重要指标整理ppt2、色谱峰

当有物质混在流动相中一起流经检测器时，所得到的高于基线的峰形

整理ppt3、流速

指流动相流经色谱柱的速度；通常以ml/min为单位

整理ppt4、拖尾峰出峰时，峰形上升很快，而后缓慢回到基线的峰

整理ppt5、伸舌峰出峰时，峰形上升缓慢，而后很快回到基线的峰整理ppt6、怪峰/鬼峰

除样品组分以外的色谱峰。这些峰的出现与色谱仪的结构、柱流失、系统污染及样品分解等因素有关整理ppt7、保留时间（tR）

样品通过色谱柱所需的时间整理ppt8、保留体积（VR）

保留时间与流速的乘积；通常以ml为单位

整理ppt9、峰宽（W）

峰两侧拐点作切线与峰底相交的两点之间的距离整理ppt10、半（高）峰宽（）

峰高一半处的峰宽；为了测量方便，通常用半峰宽代替峰宽。（峰宽有时可作为研究柱效的指标，W越窄，峰越尖，则柱效越好）整理ppt11、峰的容量因子（K，）

又称分配比、容量比，指某组分在固定相和流动相中的分配量（质量、体积或摩尔）之比；是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。（K，越大，则tR越大，洗脱就困难；反之，K，越小，则tR越小，洗脱就容易）

整理ppt（二）基本理论

1、分离度（R）

分离度既是柱效率的量度，又是溶剂（流动相、洗脱剂）洗脱效率的量度。两相邻色谱峰的实际分离度用R表示，它取决于峰宽及两峰峰顶之间的间隔整理ppt当R=0时，两峰完全重合当R＜1时，两峰明显交叠当R=1时，理论分析应刚好分离，但实际上两峰仍有部分重叠当R=1.5时，两峰可完全分开当R≥1.5时，两峰明显分开整理ppt2、塔板理论（N）

分析结果很大程度上取决于所获得的色谱图的好坏，而柱子的好坏又直接影到色谱图；因此，必须要一个判断柱子好坏（即柱效）的基准，为此提出了塔板理论色谱柱的用途就是为了完全分离各组分，而且峰的宽度愈小，分离度R愈好（

）也就是讲，峰越窄越尖，柱越好，分离度越高整理ppt塔板理论的理解

我们用柱内假想的小室—-塔板（类似于蒸馏塔的塔板）数作为柱分离能力的指标，这个数是假想的塔板数，所以称为理论塔板数。（将色谱柱分为很多假想的小室（塔板），溶质分子相继流经每个小室，在每个小室中进行一次平衡分配，再分离。那么这样的小室越多，色谱柱的分离效果就越好，即N越大，柱效越高）根据这样一个指导思想，Martin和Synge导出了理论塔板数的计算公式，或W=·W（因为中间涉及一个死时间）（式中t—保留时间；W—峰宽；W—半高峰宽）整理ppt

理论塔板数（N）表达了色谱峰的扩张程度和色谱峰的陡度，不能说明色谱柱对组分的选择性，N值越大，分离能力也就越好另外，也有用平均理论塔板高H表示柱效的

H=L/N（L—柱长）当柱长L一定时，平均理论塔板高H越小，N就越大，柱效越好整理ppt九、HPLC定性分析整理ppt1、利用保留值定性

样品经HPLC分离后，可以得到各组分的保留值数据，由于在一定的色谱条件（固定相、流动相、分离温度、检测器类型等）下，各组分的保留值一定。在各组分峰完全分离的前提下，将已知物与未知物的色谱行为进行对照，若两者完全相同，则可认为是相同的化合物。——类似于标准对照法（如图9-7）整理ppt整理ppt2、利用检测器的相对响应

为了确证化合物为同种结构的化合物，可比较这两种化合物在两个不同检测器上的相对响应值；也可比较紫外检测器上两个不同波长处的响应值，若完全一样，则可确证为同种结构的化合物整理ppt3、结合其他方法定性

利用HPLC分离得到各组分的纯物质，再用化学方法、质谱（MS）、红外（IR）、核磁共振（NMR）等方法进行分析鉴定整理ppt

十、HPLC定量分析整理ppt（一）定量分析注意事项

定量分析的精度与多种因素有关，如供试液的配制、进样技术、检测器的线性范围、分离度的适当、峰高或峰面积的测量等，操作时应加倍小心1、样品称量准确，10mg以下的样品应用微量天平称2、用高压定量阀定量3、进样量应在检测器线性范围内4、尽量提高分离度R，达到基线分离5、尽量使各组分峰完全分离，用峰面积定量（但当R=1.0~1.5时，只能用峰高定量）整理ppt（二）定量分析方法1、外标法：（1）操作步骤：将标准品配制成一系列不同浓度的溶液，在与样品测定完全相同的条件下进行定量分析，得到一条通过原点的标准曲线，然后测得未知样品的色谱图，把所得到的峰面积或峰高值与标准曲线进行对照，可得组分含量（=）（2）计算方法：含量C=C·（3）特点：简便，但重现性差整理ppt2、内标法对内标物的要求：①内标物必须是样品中不含有的组分②内标物的保留时间与待测组分相近，但又能完全分开，即R≥1.5③内标物要有足够的纯度内标物的选择原则：①内标物与待测组分只相差一个化学元素②内标物与待测组分为同系物③内标物与待测组分结构相似④有时也可选择结构不相似，但理化性质与待测组分相似的物质作为内标物（1）内标物的选择整理ppt

（2）操作步骤

第一步：

将含有内标物质的对照品溶液进行测定，根据内标物与对照品色谱峰的响应值，计算校正因子（f）f=A、A——内标物和对照品的峰面积或峰高（测得）C、C——