第四讲微生物与生物转化

4.微生物与生物转化概述生物催化剂：微生物〔细胞直接进行催化〕酶的来源，催化非天然有机物发生转化反响优点：1、同时参与反响的酶的种类多——底物范围广2、不需要进行酶的别离纯化——方便，廉价，高效3、解决辅酶再生问题缺点：1、副产物多——得率低2、产物别离纯化困难用途：有机酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、维生素、甾体激素等手性化合物的工业化生产4.1微生物学根底微生物的特点微生物〔microorganism〕：所有形态微小，单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚或没有细胞结构的低等生物的通称。微生物类群十分庞杂，包括：病毒(不具细胞结构)、立克次氏体、细菌、放线菌(单细胞)酵母、霉菌、单细胞藻类、原生动物等

原核生物：不具核膜，核物质裸露，没有有丝分裂过程真核生物：细胞核有核膜，进行有丝分裂特点1、体积小，面积大——比外表积大，代谢强度大2、种类多——10万种以上，各具特性(三废处理、合成产品)3、分布广——营养要求不高，生长繁殖速度快，土壤4、繁殖快，转化能力强5、适应性强，容易培养——诱导酶、抗逆性强、极端微生物温度、压力、高盐浓度、酸碱、枯燥、辐射、毒物等和化学合成法相比：常温常压、原料廉价、来源广、不需其他特殊催化剂、环境友好6、易变异：本质是基因突变，优点，也是缺点——可调常用微生物：细菌、放线菌、霉菌和酵母菌1、细菌：球状、杆状、螺旋状，分裂生殖，体积很小球菌：球形或椭圆形。分裂后产生的新细胞常保持一定的空间排列方式。〔单球菌、葡萄球菌等〕杆菌：杆状或圆柱形。发酵工业中最常用。螺旋菌：细胞呈弯曲杆状。〔弧菌、螺旋菌〕醋杆菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、大肠杆菌、短杆菌属

2、放线菌菌落呈放线状而得名〔Actinomyces〕厌气菌——放线菌属好气菌——链霉菌属，也是放线菌放线菌多为腐生，少数寄生。菌落特点：枯燥，不透明，外表呈紧密的丝绒状，上面有一层色彩鲜艳的干粉；菌落和培养基连接紧密，那以挑取；菌落正反面颜色常常不一致最突出的特性：产生大量的、种类繁多的抗生素

目前已发现和别离的5500种以上的抗生素，其中4400多种为放线菌所产生。实际应用的有100多种，如链霉素、井冈霉素等。此外，还可用于：

生产维生素、嵋制剂；甾体转化、石油脱蜡、烃类发酵、污水处放线菌的存在范围：土壤中最多，河流、湖泊和海洋中较少；大气中也有很多菌丝和孢子，食品、动物上放线菌为单细胞，革兰氏阳性。菌丝分为：营养菌丝、气生菌丝和孢子丝放线菌孢子较耐枯燥，不耐高温〔65度15分钟〕放线菌的代表属：链霉菌属诺卡氏菌属：可用于污水处理等放线菌属：多为致病菌小单胞菌属链孢囊菌属：可形成孢子囊和孢囊孢子游动放线菌属：孢囊孢子可以运动3、霉菌〔mold〕是一类“丝状真菌〞的通称，不是分类学上的名词，在分类学上分别隶属于藻状菌、子囊菌和半知菌。定义：凡在营养基质上生长形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌，通称为霉菌。霉菌的菌落特征和放线菌类似，但是菌落较大，质地一般比放线菌疏松。用途：酿酒、制酱、发酵工业、农业、纺织、食品、皮革加工但是也会引起发霉变质，是人和动植物致病。全世界由于霉变而不能食〔饲〕用的谷物约占2％。目前的霉菌毒素达100种以上。其中毒性最强的是由黄曲霉菌产生的黄曲霉毒素——致癌常用霉菌：a.毛酶：制作腐乳、豆豉等食品，甾体转化b.根霉：淀粉酶、糖化酶〔米根霉〕c.曲霉：制酱、酿酒、制醋、酶制剂、有机酸、糖化黑曲霉、米曲霉、黄曲霉d.青霉：产黄青霉、橘青霉、娄地青霉、展青霉e.红曲、木霉、地霉、假囊霉、脉孢菌、交链孢霉、赤霉菌、白僵菌〔生物农药，昆虫病害的防治〕4、酵母〔Yeast〕大多数酵母为单细胞。一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或者柠檬形。常用的为：酵母属〔Saccharomyces〕和假丝酵母〔Candida〕。主要有酿酒酵母、产阮假丝酵母、热带假丝酵母、毕赤酵母等。微生物菌种的别离1、采样：地点确实定：筛选目的、微生物分别特征、菌种的特征一般在土壤中。〔有的放矢〕取样范围要广2、增殖培养：一般需要进行目的菌种的富集选择有利于目的菌种生长繁殖而非目的菌种不容易生长繁殖的培养条件。如特殊底物、温度、pH、微量元素、金属离子、抑制剂等。4.2微生物的别离和选育3、纯种别离增殖培养后——各种菌种的混合物发酵或者培养要求——纯种方法：a.划线法b.稀释法目的：获得单菌落过程中也可以参加筛选控制条件，提高筛选效率4、性能鉴定两步法：初筛〔快速的培养和测定方法，也可在纯种别离时进行〕复筛〔比较复杂，精确，定量，可以确定目的菌种〕重复实验确认菌种性质，获得几株野生型菌株诱变育种野生型菌种性能尚达不到工业生产的要求，因此要进行“育种：。方法：基因突变〔自然、诱发〕

诱变：诱变剂处理〔致死率和突变率，正突变和负突变〕、高效筛选方法：可以借鉴野生型的筛选方法存在主要问题：工作量大、缺乏人工控制、提高幅度有一定限度〔尤其对于高产突变菌种〕工作程序：a.选择出发菌株〔连续诱变〕b.菌悬液的制备〔单细胞或者孢子进行诱变〕c.诱变：化学诱变、物理诱变

物理诱变剂：各种射线，最常用的紫外线，太空育种对DNA发生作用化学诱变剂：作用原理比较复杂，常用的如亚硝基胍和甲基磺酸乙酯〔EMS〕d.变异株的别离和筛选初筛：菌落形态、色泽的变化〔有时会和性质有关联〕指示平板：平板培养基中有指示剂复筛：营养缺陷型〔中间培养淘汰野生型〕缺陷的类型：氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶等发酵实验，检查其生产性能重组工程菌的构建天然微生物中所需要的酶含量少，不能适应生物催化的要求利用遗传工程技术可以构建新的工程菌大量表达生物催化所需要的酶满足工业化生产的需要操作步骤：a.载体b.基因的别离c.DNA分子的切割和连接d.引入宿主细胞e.重组体的筛选f.外源基因的表达〔转录、翻译、修饰〕原生质体技术：多酶体系的重组包括：原生质体诱变、转化或转染、融合等。

克隆天然酶基因序列直接用PCR扩增未知序列根据同类酶保守序列设计引物或探针钓基因建立genomicDNA或cDNA表达文库筛选纯化酶，测定局部序列，设计引物或探针钓基因表达系统的共性基因克隆至表达载体转化至表达宿主细胞筛选转化子生长表达蛋白质重组酶表达小结选用强启动子假设需翻译后修饰选用酵母系统蛋白质折叠和降解是高表达方案中的主要问题融合表达蛋白酶缺陷菌株发酵条件培养基：微生物的生长、繁殖、产物形成、产品提取别离工艺的选择a.提供构成细胞物质和代谢产物的有关营养物质b.提供能量c.参加前体物质用于提高产品的产量包括：碳源〔糖类、有机酸、醇和氨基酸、碳氢化合物、二氧化碳－光合作用，化学能〕氮源：有机氮、无机氮、固氮微生物〔空气中的氮〕无机元素：酶活、生长因子生长辅助物质：营养缺陷，酵母粉、麦芽汁水分：占细胞总量的80-90％气体：氧气和二氧化碳4.3微生物培养培养基优化：单因子实验、正交实验、代谢途径研究内容：种类、浓度、比例、缓冲能力和种类粘度、杂质影响、诱导物、前体、促进剂的参加量、参加时间和参加方式，各种影响因素相互的作用文献报道、菌种根本要求、同类微生物的要求细胞生长和产物形成动力学研究微生物的营养类型：a.光能自养微生物：光合作用，光为能源，无机物作为氢的受体复原二氧化碳合成有机化合物如：藻类、蓝细菌等b.光能异养微生物：有机物为氢受体复原二氧化碳合成有机物c.化能自养微生物：以无机物氧化所产生的化学能作为能源，以二氧化碳作为碳源合成有机物如：硝化细菌、硫细菌等d.化能异养微生物：大多数微生物都属于这类。腐生型和寄生型微生物的培养方法外表培养：类似自然培养固体培养：固体培养基，设备简单，自动化程度低液体深层培养：可控性好，设备投资大，工业化生产菌种的扩大培养－新鲜的种子，菌种的别离纯化和复壮一级种子：摇瓶培养，由斜面培养基中接入二级种子：种子罐，质量检查，是否染菌多级种子罐：50立的发酵罐一般使用三级发酵接种菌龄，接种量发酵：酶、次级代谢产物，纯种培养，产品提取和精制目的：使菌种的生命得以延续并保持其生物学特性菌种保藏方法：根本原理：根据微生物的生理、生化特点，人工的创造条件使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。——低温、枯燥、缺氧1.斜面保藏法：4℃可以保藏3-6个月，到期转接新鲜斜面容易发生变异、染菌，可覆盖矿物油2.穿刺保藏法：用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处，然后覆盖无菌液体石蜡〔保持水分、隔绝氧气〕从中接出来时要进行复壮4.3菌种保藏3.枯燥保藏法：适用于形成芽孢的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌。原理：将微生物吸附在各种载体上，枯燥后保藏。使用时要进行复壮，常用的为灭菌的沙子和土壤4.悬液保藏法：将微生物悬浮于不含养分的溶液中，如蒸馏水磷酸缓冲液或生理盐水中，然后密封保藏5.冷冻枯燥保藏法：保藏期长，变异小，便于大量保藏，适用范围广，是各保藏机构的主要方法原理：将微生物或者孢子冷冻，然后在减压情况下利用升华原理除去水分，使细胞的生命活度处于停止状态，然后进行低温保藏〔一般4℃〕。常用分散剂：脱脂牛奶和血清菌种：处于生长后期的微生物，一般细菌培养24小时，酵母培养72小时，放线菌和丝状菌种培养7天参加分散剂并刮下微生物菌体或孢子，制成悬液－30℃左右冷冻，真空枯燥，使水分升华枯燥完毕后，抽真空并熔封。复壮后使用6.液氮保藏法：效果好，方法简单，保藏对象最为广泛浓的悬液参加灭菌后的分散剂中，参加最终浓度10％的甘油或者5％的DMSO作为防冻保护剂，立即熔封。缓慢冷却到－25℃左右，保藏在－196℃的液氮罐中。使用时取出放入38－40℃的温水振荡融化，然后接种7.低温保藏法－20℃的低温中用15％甘油保藏。菌种保藏中心ATCC〔美国标准菌种收藏中心〕ARC〔美国农业部农业研究效劳部〕NCTC〔英国国立标准菌种收藏所〕CBS〔荷兰霉菌中心保藏所〕IFO〔日本大阪发酵研究所〕中国有7个菌种保藏中心4.5微生物生物转化定义：利用微生物中特定的酶将人工合成的非天然化合物进行生物转化，转化液经别离纯化可得到所需产品的过程。本质上与直接发酵法是一样的，为酶催化反响不同：发酵法：多酶低密度转化生物转化：单酶或者多酶的高密度转化生物转化优点：工艺简单、产物浓度高、转化率及生产效率高，副产物少微生物种类多，含酶丰富，可进行多种生物转化反应微生物生物转化反响具有高度选择性，尤其是立体选择性，可完成一般化学反响难以实现的反响如甾体、萜类与生物碱等有机化合物中非活泼氢的羟化反响反响条件温和，适用于不稳定化合物的制备一般用游离细胞或者固定化细胞培养法

游离细胞转化法：1、底物的预处理考虑底物的各种性质，包括渗透性，溶解度，稳定性和毒性等。目的：保证底物和催化反响的酶能够相互接触a.酶的位置：胞内，底物首先要和细胞充分接触b.底物要透过细胞壁和细胞膜进入胞内真菌细胞壁透过性较好，因此转化效率高细菌细胞壁透过性较差，因此转化效率低一般底物在转化体系中溶解度大，生物转化率就高常用底物添加方法：微生物转化反响一般在水溶液中进行，因此水溶性强的底物可以高效进行反响，对于水溶性差的底物(大多数生物转化的底物水溶性都比较差，非天然有机化合物)可以采用以下方法：a.无毒性的溶剂溶解底物，如乙醇、丙酮等。b.直接添加固体底物，然后添加无毒性的外表活性剂如吐温系列物，剧烈搅拌，形成乳化液，以减少传质阻力。如果底物对微生物有毒，那么会干扰微生物的生长，可以采用以下方法：a.少量屡次添加，控制底物浓度在毒性浓度之下b.分步法：首先培养细胞，然后诱导酶的产生，最后进行生物转化c.酸性或者碱性底物以盐的形式添加d.挥发性底物在密闭体系中反响e.光敏底物在黑暗条件下反响2、生长细胞培养转化法在微生物细胞培养前或者培养一段时间后，将底物直接参加到培养基中，微生物在生长繁殖的同时对底物进行生物转化。优点：容易，效率高缺点：产品别离纯化困难尤其适用于能以底物作为唯一碳源的微生物3、静态细胞